A．连接反应
1．在13m1离心管中混合下列物质：
● 20/igp8V5载体（经BstⅪ酶切和纯化）
● 1．25ug插入DNA 片段（经BstⅪ、Bsi HKAI酶切和纯化）
● 200ul 10×连接缓冲液
● 4ul T4 DNA连接酶
● 加水至反应总体积为2m1
2．于14℃孵育过夜。加入1/10体积的3mol/L乙酸钠溶液和2倍体积的乙醇。 于10000r/min转速（JA．20转子）下离心15分钟。除去上清，用400ul TE缓冲液将沉淀重悬。再加入1/10体积的3m01/L乙酸钠溶液和2倍体积的乙醇， 离心后将沉淀用70％乙醇洗涤并干燥，再加入20ul TE缓冲液将连接后的DNA重悬。
B．准备电感受态细胞
1．培养E.coli MCl061 F’菌株于1L superbroth培养基直至对数生长期中期（OD600＝0．5）。
2．在冰上冷却培养物30分钟。于4℃、5000 r/min转速（JA．20转子）下离心细菌悬液15分钟。
3．用1L冷水将细菌沉淀重悬。重复上面离心步骤，用0．5L冷水将细菌沉淀重悬。
4．重复上面离心步骤，用10ml 10％甘油将细菌沉淀重悬。于4℃6000r/min转速下离心细菌悬液15分钟。
5．用10％甘油重悬细菌沉淀，至终体积为2m1①。按每管200/ul分装后先于干冰转移到-70℃冷冻保存。
C．电转化
1，准备4个转化反应，其中每个电转化杯中含有200ul细菌和5ftl连接后的DNA，于2．5kV电压下电转化。转化后，立即将细菌转移到2m1SOC培养基中，在无选择压的条件下于37℃培养1小时。
2．将4个转化反应产物混合，并将取出少量产物以10倍递减稀释。将100ul 10-4-10-5
稀释液涂布于LB氨苄*琼脂培养基平板上，根据菌落生长数计算转化的效率。剩 余的转化反应产物加入到500m1SOPamp/glu培养基中，于37℃振摇培养直至OD600值达到0．8。
3．取100m1上述培养物，按照实验方案6．4从库中生成噬菌体。剩余的细胞悬液于6000r/min转速下离心10分钟。
4．用10m1LB培养基/15％甘油重悬细菌沉淀，将其转移到Nunc冻存管中，每管1m1，并将其于-70℃冷冻保存，以备将来扩增库之用。

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