猴肿瘤坏死因子（TNF-α）ELISA试剂盒

猴肿瘤坏死因子（TNF-α）ELISA试剂盒说明书

本试剂盒仅供研究使用                                       

预期应用

ELISA法定量测定猴血清、血浆、痰液、细胞培养物上清或其它相关液体中TNF-α含量。

概述

肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor，TNF）是一种具有多种生物活性的细胞因子。猴TNF-α基因编码前体蛋白，其信号肽将前体蛋白固定在细胞膜上，成为具有活性的跨膜干扰素（TNF），分子质量为26×10³，经酶切去除信号肽生成分泌型TNF-α，分子质量为17×10³。TNF-α细胞来源广泛，包括各种免疫细胞、内皮细胞、成纤维细胞、表皮细胞、角质细胞、平滑肌细胞、星形细胞、成骨细胞等。

    TNF-α具有广泛的生物学活性，如：参与炎性反应和免疫应答，抗肿瘤，参与内毒素性休克等病理过程，引起恶病质等。其具有双重作用，,一方面在机体免疫调节，机体生理功能和抗感染等方面发挥重要作用，另一方面若持续释放或产生过多则会引起发热!、休克、恶病质等，同时TNF-α可进一步诱导IL-6、IL-8、IL-10等细胞因子的产生，这些促炎性细胞因子参与体内急性反应、发热反应、引起趋化肽释放等，还可使内皮细胞活化而导致血管通透性增加。

实验原理

本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中TNF-α水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入TNF-α抗原、*化的抗大鼠TNF-α抗体、HRP标记的亲和素，经过*洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的TNF-α呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

试剂盒组成

1.         酶联板：一块（96孔）

2.         标准品（冻干品）：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为10 ng/mL，做系列倍比稀释后，分别稀释成10 ng/mL，5 ng/mL ，2.5 ng/mL，1.25 ng/mL，0.62 ng/mL，0.31 ng/mL，0.16 ng/mL，其原液直接作为zui高标准浓度，样品稀释液直接作为标准浓度0 ng/mL，临用前15分钟内配制。

3.         样品稀释液：1×20ml/瓶。

4.         检测稀释液A：1×10ml/瓶。

5.         检测稀释液B：1×10ml/瓶。

6.         检测溶液A：1×120ul/瓶（1：100）临用前以检测稀释液A1：100稀释。稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100ul），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如1ul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。

7.         检测溶液B：1×120ul/瓶（1：100）临用前以检测稀释液B1：100稀释。稀释方法同检测溶液A。

8.         底物溶液：1×10ml/瓶。

9.         浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。

10.     终止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。

标本的采集及保存

1．细胞培养物上清：请离心后收集上清，并将标本保存于-20℃，且应避免反复冻融。

2．血清：标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。

3．血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。

注：标本溶血会影响zui后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

操作步骤

实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。

1.         加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100ul，余孔分别加标准品或待测样品100ul，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。

为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2.         弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液 100ul（取1ul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃,60分钟。

3.         温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干。

4.         每孔加检测溶液B工作液（同检测A工作液） 100ul，37℃，60分钟。

5.         温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干。

6.         依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。

7.         依序每孔加终止溶液50ul，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8.         用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。 在加终止液后15分钟以内进行检测。

注：

1． 每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是zui后加底物溶液及2NH2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。

2．为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜。

3.  未使用完的酶标板或者试剂，请于2-8℃保存。标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A工作液或检测溶液B工作液。

4.  建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层

吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.4ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需要，重复此过程数次。
    自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

特异性

    本试剂盒可同时检测重组或天然的猴TNF-α，且与其它相关蛋白无交叉反应。

计算

  以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

注意事项

1．  洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。

2．  一次加样时间控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

3．  请每次测定的同时做标准曲线，做复孔。

4．  如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请zui后乘以稀释倍数。

5．在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。

6．底物请避光保存。

检测范围：

0.15 ng/mL -10 ng/mL

说明

1．试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。

2．有效期：6个月

3．浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。

4．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。

5．刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。

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