PPM1A蛋白的表达纯化及鼠多克隆抗体制备研究——2

2　结果
2.1　目的蛋白的表达　SDS2PAGE电泳可见,pBEX2PPM1A2His经IPTG诱导2、4h后在大肠杆菌中均有表达,4h时获得量zui大,空菌诱导4h仅有较弱条带。且PPM1A的产量随IPTG的浓度加大变化不大.
2.2　目的蛋白的纯化和复性　诱导后的菌体处理后经超速离心,SDS2PAGE电泳发现大部分目的蛋白存在于沉淀中,主要以包涵体形式存在。用Ni2NTA纯化试剂盒处理所得的目的蛋白纯度达90%,质量浓度为2.45mg/mL,复性后目的蛋白质量浓度为1.15mg/mL。
2.3　目的蛋白的Western2blot鉴定　空菌组无明显条带,诱导菌组可见较强条带,提示IPTG诱导后所得的蛋白为目的蛋白。
2.4　多克隆抗体滴度检测　纯化的PPM1A重组蛋白0.1g/mL每孔100L包被,ELISA法测得的抗体滴度达到1∶100000。
2.5　多克隆抗体的特异性检测　PPM1A多克隆抗体1∶800作为*抗体,用Envision免疫组化法检测肝癌组织Edmondson病理分级Ⅰ级中PPM1A的表达,同时用PPM1A鼠单克隆抗体和正常小鼠血清分别为阳性对照和阴性对照为*抗体检测,结果可见PPM1A多克隆抗体组和PPM1A鼠单克隆抗体阳性对照组的肝细胞胞核和胞浆明显阳性表达,而正常小鼠血清组则无着色;另也用免疫荧光法检测HepG2细胞中PPM1A的表达,PPM1A多克隆抗体1∶50组细胞的胞核阳性着色,正常小鼠血清组则未见明显荧光。
3　讨论
PPM1A蛋白磷酸酶1A（以前2C）（PP2CA;MGC9201;PP2C2ALPHA是一种抑癌基因,定位于染色体14q23.1,47604bp,属于丝/苏蛋白磷酸酶的PP2C家族,为一常见的镁或锰离子依赖的去磷酸化酶,定位于胞浆和核,使MAP激酶和MAPK激酶去磷酸化而起负调节作用;能使细胞周期蛋白依赖的激酶去磷酸化,参与细胞周期的调控;可抑制环境应激反应诱导的p38和JNK激酶级联作用;其过量表达可激活抑癌基因TP53/p53的表达,导致细胞周期停滞于G/M期和引起细胞凋亡,从而可能参与肿瘤的发生机制调节。
TGF2家族成员广泛存在于从果蝇到人类的多种生物的各种组织中,控制多种正常细胞的发育过程,参与一些癌症、自身免疫疾病和纤维化疾病的发生发展。TGF2信号通路的应答中一个关键的步骤就是Smad2被TGF2受体II磷酸化后与Smad3,Smad4形成复合体,移位细胞核中,与序列特异的DNA结合蛋白CRB/P300等结合,启动TGF2通路,激活特定的靶基因。Xu等人研究认为Smad2的磷酸化与去磷酸化对TGF2信号通路的调节起重要作用,而近期发现PPM1A就是那种特异的去磷酸化酶,促进核中Smads的去磷酸而转移出核,PPM1A的异常表达会消除TGF2诱导的抗增生核转录反应,但是删除PPM1A会使哺乳动物细胞中的TGF2号途径活性增高。资料显示TGF2/Smads通路是肝脏细胞生长的一个重要调节因子,参与肝细胞的生长、分化、黏附、转移、细胞外基质的形成及免疫调节等,肝癌组织中磷酸化Smad2核聚集可与肝脏肿瘤的恶性程度密切相关。故而,进一步深入研究肝组织中PPM1A的功能有深远意义。
该试验中,我们利用制备的PPM1A鼠多克隆抗体,采用免疫组化法检测肝癌组织中PPM1A的表达,显示其结果与用PPM1A单克隆抗体检测相似,用免疫荧光法检测了HepG2细胞中的PPM1A的表达主要定位于胞核,与文献报道的结果一致示了PPM1A鼠多克隆抗体能特异地检测肝组织中PPM1A的表达,为下一步深入研究肝细胞中PPM1A的功能以及与TGF信号通路的对肝癌发生的影响等研究打下了基础,为寻找新的治疗策略提供了参考资料。