人抗血小板抗体IgM（PA-IgM）ELISA试剂盒使用说明书

人抗血小板抗体IgM（PA-IgM）ELISA试剂盒使用说明书

本试剂盒仅供研究使用

产品编号：CSB-E05177h

zui低检测限：1 ng/ml

特异性：本试剂盒可检测人PA-IgM，且与其他相关抗体无交叉反应。

有效期：6个月

预期应用：ELISA法半定量测定人血清、血浆或其它相关生物液体中PA-IgM含量。

说明

1．试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。

2．浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。

3．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。

4．刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。

实验原理

用纯化的血小板裂解抗原包被酶标板，制成固相载体。向微孔中先加入待测样品进行反应，然后再加入辣根过氧化物酶标记抗人IgM进行反应，经过*洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的PA-IgM呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品中抗体的效价（抗血清zui终能显色的zui高稀释倍数记为效价）。

试剂盒组成及试剂配制

1.         酶联板（Assay plate ）：一块（96孔）。

2.         样品稀释液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶。

3.         辣根过氧化物酶标记抗人IgM稀释液 （HRP-anti-human IgM Diluent）：1×10ml/瓶。

4.         辣根过氧化物酶标记抗人IgM（HRP-anti-human IgM）：1×120μl/瓶（1：100）。

5.         底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。

6.         浓洗涤液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。

7.         终止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。

需要而未提供的试剂和器材

1.         标准规格酶标仪

2.         高速离心机

3.         电热恒温培养箱

4.         干净的试管和Eppendof管

5.         系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，用多通道移液器

6.    蒸馏水，容量瓶等

标本的采集及保存

1.         血清：全血标本请于室温放置2小时或室温过夜后于1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.         血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.         细胞培养物上清或其它生物标本：1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

注：标本溶血会影响zui后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

标本的稀释原则：

首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量，确定适当的稀释倍数。稀释的过程中，应做好详细的记录。zui后计算抗体效价时，稀释了“N”倍，标本中抗体的效价为“N”。

辣根过氧化物酶标记抗人IgM的稀释原则：

临用前以辣根过氧化物酶标记抗人IgM稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100μl），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根过氧化物酶标记抗人IgM加990μl辣根过氧化物酶标记抗人IgM稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。

操作步骤

实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。

1.         加样：分别设空白孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔加待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。

2.         弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加辣根过氧化物酶标记抗人IgM工作液 100μl（取1μl*标记抗体加99μl*标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃，60分钟。

3.         温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。

4.         依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见孔内有明显蓝色，即可终止）。

5.         依序每孔加终止溶液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

6.         用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。 在加终止液后15分钟以内进行检测。

注：

1. 用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。

2. 每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是zui后加底物溶液及2N H₂SO4。测量时先用此孔调OD值至零。

3. 为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜。

4. 未使用完的酶标板或者试剂，请于2-8℃保存。辣根过氧化物酶标记抗人IgM工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的辣根过氧化物酶标记抗人IgM工作液。

5. 建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需要，重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

计算

为检测样品中PA-IgM效价，客户可以采取样品2倍倍比稀释样品计算抗体效价，一般采取以1:40为起始稀释倍数（使用样品稀释液进行稀释）。zui大稀释倍数根据客户自身试验要求而定，zui终显色与阴性对照孔进行比较，有明显差异的zui大稀释度定为抗体的zui终效价。

注意事项

1. 当混合蛋白溶液时应尽量轻缓，避免起泡。

2. 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。

3. 一次加样时间控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

4. 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请zui后乘以稀释倍数。

5. 在配制检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。

6. 底物请避光保存。

7. 不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。

厦门慧嘉生物科技有限公司专业代理众多生命科学领域的。致力于各种ELISA试剂盒、免疫组化试剂盒、一抗二抗、细胞因子、生物试剂、移液器、耗材的销售推广及服务工作。
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