一种构建重组质粒的简便方法

克隆的道路有很多条，比如TA克隆、不依赖连接反应的克隆（LIC）、重组酶依赖的克隆等等。TA克隆和LIC都需要末端修饰，而这种修饰不容易被凝胶电泳等技术检测。重组酶通常又是和克隆试剂盒捆绑销售的，因此研究人员也很难优化重组反应。于是，美国艾默里大学生物化学系的Anton V. Bryksin和Ichiro Matsumura开发出一种PCR介导的克隆方法-重叠延伸PCR克隆（Overlap extension PCR cloning），相当简单且可靠。

克隆过程如下：一开始用嵌合体引物进行PCR扩增，产生了线性的插入片段，且片段两端都有载体序列。然后将载体和插入片段混合，变性并退火，随后将载体作为模板，用Phusion DNA聚合酶延伸杂交后的插入片段，直到聚合酶到达插入片段的5’端。在几轮PCR循环后，反应的终产物是带有两个缺口（每条链一个）的双链融合质粒。利用DpnI限制性内切酶消化，除去母板质粒，新质粒则转化到大肠杆菌中，DNA修复酶将缺口封住。

研究人员在反应中使用的是NEB公司的Phusion DNA聚合酶，他们认为这很关键，因为此酶保真度高，且不拥有链置换活性。研究人员还比较了五种不同的DNA聚合酶，认为这个。反应中只需要DNA聚合酶，而不再需要操作多个限制性内切酶、重组酶、连接酶和糖基化酶等。

在原理验证的实验中，研究人员首先克隆了gfp。他们认为，高浓度的插入片段和相对低的退火温度（比计算出的退火温度低5-10°C）对于的重叠延伸是很重要的。转化后的重组子有98%以上呈绿色，说明克隆错误和原始载体的残留极低。

研究人员还比较了PCR循环数对克隆效率的影响。他们发现：在zui初15个循环，重组克隆数量不断增加，在17-18个循环达到高峰。之后的循环导致克隆数量略微下降。随后，他们还比较了三种不同的载体：插入片段比例（1：5、1：50和1：250）。他们发现，1：250的比例产生了zui多的重组克隆。