蛋白表达系统研究进展

上世纪70年代初，在遗传学、分子生物学、生物化学、微生物学等学科发展的基础上，出现基因工程，后又被称为重组DNA技术。这项技术为任何一种生物接受另一种生物的遗传物质并在其细胞内表达功能和稳定遗传提供了可能性，也为我们在试管 内直接操作遗传物质改变基因功能、调节基因表达方式创造了条件。经过近40年的发展，基因工程技术已被广泛应用于生命科学各个学科的基础研究，成为微观生物学，甚至宏观生物学有力的研究手段。这项技术也在农业、医药、食品、化工和环保等领域结出了丰硕的应用成果。在基因工程技术的基础上已出现了蛋白质工程、基因治疗、DNA药物和新一代的代谢工程等多个生物技术生长点，展现出越来越广阔的应用前景[1]。
基因工程技术的核心是基因表达技术。至今，人们已建立了许多基因表达系统，既有原核生物基因表达系统，也有真核生物基因表达系统。不同的表达系统特点不同，有它们的优势，也有它们的不足。另外，由于研究深度的差异，它们的成熟程度和应用范围也很不一样。
1.大肠杆菌表达系统
在各种表达系统中，zui早被采用进行研究的是大肠杆菌表达系统，也是目前掌握zui为成熟的表达系统。其主要方法是将已克隆入目的基因DNA片段的载体 （一般为质粒）转化细菌（通常选用的是大肠杆菌），通过IPTG等诱导并zui终纯化获得所需的目的蛋白。
对于表达不同的蛋白，需要采用不同的载体。目前已知的大肠杆菌的表达载体可分为非融合型表达载体和融合型表达载体两种。非融合表达是将外源基因插到表达载体强启动子和有效核糖体结合位点序列下游，以外源基因mRNA的AUG为起始翻译，表达产物在序列上与天然的目的蛋白一致。融合表达是将目的蛋白或多肤与另一个蛋白质或多肽片段的DNA序列融合并在菌体内表达。融合型表达的载体包括分泌表达载体、带纯化标签的表达载体、表面呈现表达载体、带伴侣的表达载体[2]。
作为发展zui早、目前应用zui广泛的经典表达系统，大肠杆菌表达系统优点在于遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、表达产物容易纯化、稳定性好、抗污染能力强以及适用
范围广等[3]。但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难；而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。
2. 酵母表达系统
酵母表达系统作为一种后起的外源蛋白表达系统，由于兼具原核以及真核表达系统的优点，正在基因工程领域中得到日益广泛的应用。zui早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母。酿酒酵母（Saecharomycesc erevisiae）在酿酒业和面包业的使用已有数千年的历史，被认为是GRAS （generally recognized as safe）生物，不产生毒素，完整的基因序列也于1996年完成测序[4]，长期广泛应用于食品工业，已被美国FDA确认为安全性生物，其表达产物不需经过大量的宿主安全性实验。但与新型酵母体系相比，酿酒酵母表达系统存在不适合高密度培养、缺乏强有力的严格调控的启动子，而且分泌效率较低，尤其是许多分子量大于30kD的外源蛋白几乎不分泌等缺点，通常不被看作是重组蛋白的理想宿主。
后来人们又相继开发了裂殖酵母、甲醇酵母等。其中，甲醇酵母表达系统是目前应用zui广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有H Polymorpha，Candida Bodini，Pichia Pastris 3种，并以Pichia Pastoris应用zui多。甲醇酵母的表达载体为整合型质粒，载体中含有与酵母染色体中同源的序列，因而比较容易整合入酵母染色体中。大部分甲醇酵母的表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶 基因—1（AOX1），在该基因的启动子（PAOX1）作用下，外源基因得以表达。PAOX1是一个强启动子，在以葡萄糖或甘油为碳源时。甲醇酵母中AOX1基因的表达受到抑制，而在以甲醇为*碳源时PAOX1可被诱导激活，因而外源基因可在其控制下表达,将目的基因多拷贝整合入酵母染色体后可以提高外源蛋白的表达水平及产量[5]。此外甲醇酵母的表达载体都为E.coli／Pichia Pastoris的穿梭载体，其中含有E.coli复制起点和筛选标志，可在获得克隆后采用E.coli细胞大量扩增。甲醇酵母一般先在含甘油的培养基中生长。培养至高浓度。再以甲醇为碳源。诱导表达外源蛋白。这样可以大大提高表达产量。利用甲醇酵母表达外源性蛋白质其产量往往可达克级。与酿酒酵母相比其翻译后的加工更接近哺乳动物细胞，不会发生超糖基化。
3. 昆虫表达系统
昆虫表达系统是一类应用广泛的真核表达系统，它具有同大多数高等真核生物相似的翻译后修饰加工以及转移外源蛋白的能力。利用重组杆状病毒在昆虫细胞体系中表达外源蛋白
是目前较为流行的表达方式，其表达的蛋白水平高达1~500mg/L，但受到诸多因素的限制和影响，如培养基质量、供氧情况、保证对数生长等[3]。
杆状病毒是已知昆虫病毒中zui大的类群，是发现zui早、研究zui多且适用意义很大的昆虫病毒。杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小为80~160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。DNA复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体[6]。另外，此系统所用的多角体蛋白启动子，是一个很强的真核生物启动子。常用的杆状病毒包括苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcNPV）和家蚕型多角体病毒（BmNPV），常用的宿主细胞则来源于草地夜蛾Sf9细胞，用于表达外源基因的质粒来源于PUC系列，其含有一个多克隆位点和多角体蛋白启动子。杆状病毒系统的主要有点包括①重组蛋白具有完整的生物学功能，如蛋白的正确折叠、二硫键的搭配；②蛋白翻译后的加工修饰；③表达水平高，可达总蛋白 量的50%；④可容纳大分子的插入片段；⑤能同时表达多个基因。主要缺点是外源蛋白表达处于极晚期病毒启动子的调控之下，这时由于病毒感染，细胞开始死亡[7]。
4. 哺乳动物表达系统
哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载体的感染。利用质粒转染获得稳定的转染细胞需几周甚至几个月时间，而利用病毒表达系统则可快速感染细胞，在几天内使外源基因整合到病毒载体中，尤其适用于从大量表达产物中检测出目的蛋白。哺乳动物细胞表达载体必须包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸 信号等控制元件[3]。
根据目的蛋白表达的时空差异，可将表达系统分为瞬时、稳定和诱导表达系统。瞬时表达系统是指宿主细胞在导入表达载体后不经选择培养，载体DNA随细胞分裂而逐渐丢失，目的蛋白的表达时限短暂；瞬时表达系统的优点是简捷，实验周期短。稳定表达系统是指载体进入宿主细胞并经选择培养，载体DNA稳定存在于细胞内，目的蛋白的表达持久、稳定。由于需抗性选择甚至加压扩增等步骤，稳定表达相对耗时耗力。诱导表达系统是指目的基因的转录受外源小分子诱导后才得以开放。采用异源启动子、增强子和可扩增的遗传标记，可提高蛋白产量[8]。
哺乳动物表达系统在蛋白的起始信号、加工、分泌、糖基化方面具有*优势，适合表达完整的大分子蛋白。由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的外源蛋白质，在活性方面远胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统，更接近于天然蛋白质，但构成复杂、
操作技术要求高、表达产量不大、产率低，且有时会导致病毒感染等是该表达系统的不足之处。
5. 植物表达系统
植物能够表达来自动物、细菌、病毒以及植物本身的蛋白质易于大规模培养和生产，且在基因表达与修饰及安全性方面有特别的优势，因此利用植物生产外源蛋白质的研究展现了极其诱人的前景。多种抗体、酶、激紊、血浆蛋白和疫苗等都已通过基因工程的手段在植物的叶、茎、根、果实、种子以及植物细胞和器官中得到表达，然而提取与纯化始终是大规模利用植物生产重组蛋白的主要障碍。Doloressa等[9]据内质网和内质网信号肚在蛋白质合成中的作用，把3种重组蛋白，即嗜热细菌来源的木聚糖酶、水母的绿色荧光蛋白和人胎盘分泌的碱性磷酸酶 （SEAP）定位到质外体中，通过根分泌和叶分泌途径获得表达，从而建立了两种新的重组蛋白表达系统——植物根分泌和叶分泌，简化了分离和纯化程序，为利用转基因植物大规模生产重组蛋白提供了潜在的途径。虽然利用植物表达、生产外源性蛋白起步较晚，但目前已经能够利用植物生产多种医用、食用以及工业用蛋白及酶制剂。
总之，各种表达系统各有其优缺点，大肠杆菌和酵母表达系统蛋白表达水平高，生产成本低，但它们的加工修饰体系与昆虫细胞、哺乳动物细胞不*相同；哺乳动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白质，但其表达量低、操作繁琐。各种表达系统由于翻译后的加工不*相同，因而产生的重组蛋白的生物学活性和免疫原性有时会有差别。因此，选择表达系统时，必须充分考虑各种因素，如所需要表达的蛋白是否有毒性，是否有活性，是否需要糖基化，还需要考虑成本、产量及纯化路线和安全性，权衡利弊后在研究工作积累和实践探索的基础上，做出谨慎的判断和选择。
 

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