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植原体菌种保藏技术

2010年08月15日 11:48:17人气:1042来源:上海瑞齐生物科技有限公司

植原体是一类无细胞壁的原核微生物,能侵染包括农作物、林木、花卉、杂草等植物,给农、林业生产带来巨大损失,近年来,此类病害在某些重要植物处于蔓延和加重的趋势。这类微生物尚不能在人工培养基上离体培养,其细胞结构、与寄主植物的互作等方面也有其明显不同特点,研究制定此类微生物的保藏技术规程,对于植原体菌种资源的规范和安全保藏、科学研究及合理利用具有重要意义

1   范围本规程规定了植原体菌种保藏的基本原则、方法及技术要求。

本规程适用于各类植原体菌种的保藏。
2   术语与定义
2.1植原体  phytoplasma
指寄生于植物韧皮部和介体昆虫体内的、具有三层单位膜结构的无细胞壁的原核生物。一般引起植物叶片黄化和发育畸形等症状。
2.2植物组织培养  plant tissue culture
在无菌的条件下,将离体的植物器官和组织在人工控制的环境下培养,使其再生形成完整植株的过程。培养植原体—植物共生体即是培养已感染植原体病菌的植物外植体。
 
3   原理
植原体菌种尚不能在离体人工培养基上培养。被感染的寄主植物携带植原体,因而通过对植物茎段的繁殖,即可达到对所携带植原体的繁殖和培养。植物组织培养和营养繁殖,使植原体所受的选择压力较低,较低的温度条件可大大减缓植物和所感染植原体的代谢活动,从而减少菌株突变,降低繁殖速度,有效保持菌种原有性状。
4技术要求
4.1   保藏方法
用组织培养法保藏感染植原体的植物组织,于5-25 C温度范围内保藏。
4.2植物组织培养基
选用适于植物组织正常生长的培养基,不含四环素簇抗生素或其它对植原体生长和繁殖有抑制作用的成分。
4.3   培养温度和光照
培养温度20-28 ℃为宜
光照强度在1000-3000  lx,光期为10-14h/d
4.4   保藏温度和时间
常温保藏(20-28 ℃),保藏时间1-3个月
低温保藏(6-10 ℃),保藏时间6个月至1年。
注:保藏温度低于4 ℃会冻伤植物组织材料而导致植原体死亡。
4.5   保藏期检测
定期检查保藏菌种的房间、冷库、冰箱的温度、湿度。
检查各保藏试管有无杂菌污染现象,如发现杂菌污染,则取出该管重新移植,培养后补缺。
4.6移植复核
大量植原体-植物共生体进行移植时,各菌株的编号、所用培养基需仔细核对无误。每次移植培养后,对照原保藏的菌株和菌种顺序号卡片名录,核实无误再行存放。
4.7     保藏指标
当获得的组培苗表现典型症状或在荧光显微镜下观察到特异植原体 DNA 荧光后即可进行菌株的保藏。
5     操作方法与步骤
5.1   带菌外植体采集
在田间采集表现典型症状的新鲜枝条,剪去叶和嫩稍,经酒精和升汞等消毒剂表面消毒后,截成具节茎段,移入培养基上培养。
5.2   无杂菌组培苗的获得
外植体长出新枝后,选无杂菌感染的外植体,截取新枝,移入新配制的培养基上培养和繁殖。如培养基被杂菌污染,将组培苗再进行表面消毒处理,移入新的培养基上培养,重复操作2-3次,直至获得无杂菌组培苗为止。
5.3    组织带菌鉴定
用DAPI荧光显微镜技术和PCR技术鉴定组织带菌状况和浓度。
DAPI荧光显微镜技术步骤:取植物幼茎、叶柄或根等,进行组织切片,厚度在100mm左右,用5%戊二醛固定2小时左右,用0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)洗涤后,用1mg  /ml  4'6-二眯基-2-苯基吲哚(DAPI)染色,zui后置于落射荧光显微镜下检查韧皮部特异性植原体DNA荧光,激发滤光片波长为365nm,阻断滤光片波长为420nm。
PCR技术步骤:从组织中提取植物和植原体总DNA,用植原体16S  rRNA等基因序列的引物进行PCR基因扩增,然后进行琼脂糖电泳,检测特异性扩增产物谱带。
5.4  常温保藏
植原体-植物共生体在适宜的组织培养基上培养,并正常温度和光照下(20-28 C,光照强度在1000-3000  lx)进行保藏,保藏周期为1-3个月。
5.5   低温保藏
将正常温度和光照下(20-28 C,光照强度在1000-3000  lx)培养的植原体-植物共生体移入含组织培养基的试管内,移入6-10 C低温冷藏柜内保藏,1-2个月将试管暴露于正常培养温度和光照条件下补光2-3天,然后存放于低温冷藏柜继续保藏,保藏周期为6个月至1年以上。
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