荧光PCR的分析方法

对荧光定量PCR结果的分析方法我们分为两种：定量分析法和相对定量分析法。

1、定量分析方法，起始浓度的对数跟循环数的线性关系，标准曲线由已知拷贝数的标准品绘制，根据样品的Ct值，可求样品的模板量。

（1）标准品的制备：

1V的样品原液（i）+9V稀释缓冲液，得到ii；

1Ｖ的ii +9V稀释缓冲液，得到iii；

1V的iii + 9V稀释缓冲液，得到iv；

1V的iv +9V稀释缓冲液，得到v。

（2）拷贝数的计算：待测样本浓度（ng/ul）=OD260×40*稀释倍数

样品分子量+碱基数×324

待测样本拷贝数=待测样本浓度/样本分子量×6×1014

从扩增数据得到循环数，通过标准曲线，我们可以求出样品的拷贝数。

2.相对定量分析方法：

其又可有双标准曲线法和双Ct法。所谓相对，就只是实验前后结果的对比，反映了反应前后的数据的差值。

（1）双标准曲线法，分析简单，但是对于每一个基因，每一轮实验都需要做标准曲线，而且必须有特定的标准品作标准曲线，这样的标准品不代表样品扩增的真实状态。这种方法常用于基因表达调控。

Ｆ＝待测样品目的基因浓度/待测样品参照基因浓度÷对照样品目的基因浓度/对照样品参照基因浓度

（2）双Ct法，此方法不用对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需要对待测样品分别进行ＰＣＲ扩增即可，标准曲线的差值＜０．１．假若扩增效率为１００％或标准曲线及每次扩增之间的效率都保持一致，这样实验条件优化较难为复杂。这种分析方法较长用于基因表达调控研究中。