在混悬液中结合：抗体—微珠匀浆法

一种在抗体—微珠基质上快速捕获抗原的方法是将抗原溶液与微珠混合，旋转或振荡制成匀浆。这种方法可使抗原和固相化的抗体之间zui大限度地接触，是一种促使结合反应快速完成的方法。结合反应完成后，将匀浆装入层析柱内以便收集微珠和洗脱抗原。此法可以很好地控制反应时间，使基质上的抗体结合容量达到zui充分的利用。这比以上介绍直接用层析柱捕获抗原的方法稍微麻烦一些。主要是因为将匀浆装柱比较困难；另一个问题是在混匀过程中会增加抗原溶液中变性蛋白的量，所以使用这种方法的本底可能较高。

1．准备工作
在开始工作前，要考虑装填微珠的层析柱的类型及大小。如果微珠的柱床体积宽而浅，洗脱的峰形比较清晰，而且比较容易回收，将其贮存于另一个容器中供下次使用。层析柱太粗的缺点是在更换洗脱缓冲液时会扰动影响微珠。

2．所需溶液和特殊设备
结合缓冲液（通常为PBS）；
摇床；简便的层析设备。

3．操作步骤
（1）将抗体—微珠基质加入抗原制品内。所加微珠的体积应通过预备试验确定，调整微珠的用量，使其结合反应所需时间内刚好能将所有的抗体分离。微珠的zui终浓度大约为lml湿珠加到10—20ml缓冲液中。
（2）4C孵育微珠—抗原匀浆，并轻轻混合。常用的方法是在一封闭的容器中振荡或置平板摇床上涡旋混匀。孵育时间根据步骤（1）的预备试验确定。开始试验时可以先孵育2h。
（3）将微珠匀浆转移到一个大小合适的层析柱中。将匀浆倒入柱内，并用抗原缓冲液洗下混合容器中残留的微珠，将洗涤液一道加入柱内。
（4）用20倍柱床体积的结合缓冲液洗涤微珠。
此时制备好的层析柱可进行进一步洗涤或洗脱。

4．常见问题
这种方法zui大的问题是蛋白质非特异地结合到微珠上。这些蛋白可在洗脱时出现，从而使纯化效率降低。基质本身和抗体—基质复合物表面都可以非特异地结合抗原溶液中的蛋白质，尽管这些反应一般要比抗体—抗原间的反应弱，但在起始的抗原制品中如会有过量的非特异性蛋白就意味着在分离过程中将产生内在的高本底。以下几种方法可使非特异性结合降到zui低限度。
首先，如同其他亲和纯化法一样，所用基质的量必须调整到刚好在其饱和水平之上。保持抗体—微珠基质的用量，使非特异性本底尽可能降低。微珠的用量可通过预试确定，并监测不同体积的抗体—微珠基质所获得的抗原量。
第二种方法是降低柱上的非特异性吸附量。许多吸附到柱基质上的蛋白质是部分或全部变性的蛋白。在制备抗原溶液时，机械性用力要尽可能轻。在结合阶段，用机械振动使微珠保持混悬状时，动作亦应尽可能轻，并避免过度与空气接触。另一种非特异性吸附来自某些异常的小碎片，在将微珠转移到柱中后，可被柱基质截留。在将抗原溶液加入微珠之前，先将抗原溶液经过100 000g离心30min，可去除制品中大的凝聚物。
第三种降低本底的方法是在装好柱后用缓冲液洗涤微珠，以去除非特异性蛋白。任何不干扰抗原抗体反应的缓冲液都可以用于消除非特异性结合。详见表9．5洗涤缓冲液的应用。