关于基线噪音，来源和解决办法都在这里了

1. 流动相的在线混合

所有的流动相在线混合都是从方便出发的结果，流动相混合的不充分是基线噪音的一个重要来源，混合方式主要两种：

a. 低压混合：采取时间脉冲的方式，利用比例阀，将不同流动相按一定比例混合。

b. 高压混合：利用多个泵头，控制每个泵的流量，来将流动相按一定比例混合。

在流动相混合后，一般都有一个混合器(Mixer)，来帮助混合的更加充分。从流动相开始混合在一起，到流动相到达色谱柱头，这一段体积叫做延迟体积(Delay Volume)。 Mixer体积越大，混合越好，但是相应延迟体积就越大，造成梯度的延迟。换句话说，就是流动相的变化，需要一定时间后，才能真正到达色谱柱，对分离产生影响。

a. 这个现象在使用UPLC或者UHPLC的时候，会有比较明显的作用。

b. 为什么相同梯度方法，在不同仪器，或者不同品牌的仪器之间转化时，保留时间可能不一样？ 其主要原因就是延迟体积的不同。

在线混合很难做到非常均一的混合效果，这个在示差检测器（RID）上的效果zui明显。这也是为什么示差检测器都要求将流动相预混到一个瓶子里，不能走梯度的原因。

那如何减小因为混合而造成的基线噪音呢？

a. 对于等度的方法，非常简单，预混流动相就可以了。

b. 对于梯度的方法，部分预混流动相也会帮助更好的混合，怎么做呢？看下面的例子。
方法要求乙腈/水比例从10%走到85%。 那可以将流动相A配成10%的乙腈，流动相B配成85%的乙腈，然后A/B梯度从0%走到100%。这就是部分预混。

c. 增大Mixer的体积。一般mixer的体积从几百ul到几个ml都有，在允许的延迟时间下，更换一个体积更大的Mixer，能够有效提高混合的效率。每个se生产厂家的Mixer体积都不一样，基本都可以混用。有碰到过一个Agilent的1100基线噪音大，后来换成1050的mixer就好了，因为1050的mixer比较大一些。

2．液相硬件问题造成的基线噪音

如果液相系统某些地方的工作不正常，也可能造成基线的噪音。

a. 系统有漏。特别是肉眼无法发现的微漏或者泵的内漏，会造成流速的变化和混合比例的变化，从而导致基线噪音。检查的方法就是对系统进行压力测试：将系统从某个地方用死堵堵上，如泵出口，或者自动进样器出口，将压力升高到350bar后停泵，监测压力下降的情况。一般的标准是2-3bar/min的下降是正常水平。或者15%/10min的下降。

b. 梯度比例问题。可以对系统进行一个梯度测试，来检查梯度混合是否准确和一致。将A配成0.1%的丙酮，B是水。在265nm的波长下，将A的比例10%，20%，30%这样一个一个的升高，每个比例走3min。可以根据计算，看每个基线台阶上升是否准确。 也可以从0-100%走一个连续的梯度，看基线上升的平滑性和线性。

3．流动相脱气不好造成的基线噪音

对流动相进行脱气，不仅仅是为了防止系统里面气泡的产生。 流动相脱气越好，基线就会越好。如今zui常用的脱气方式是在线脱气机，但是有的时候脱气并不*。所以当有基线噪音问题是，可以考虑采取多种的脱气方式。

4．系统洁净程度

前面1-3点讲的都是内在原因，造成的基线噪音或者波动。如果你前面的原因都找过了，问题还没有解决，就得考虑一下是不是流动相里面是否有杂质了。如何检查判断是否为流动相的问题呢？

a. 每次更换一种流动相，看基线结果。

b. 重新配置所有流动相。这种方式比较快，但可能无法找到根本原因。

要特别注意在流动相的配置过程中，是否引入了污染，比如使用了不干净的玻璃器皿什么的。更换溶剂的品牌和批次也是方法之一。

色谱柱长期使用造成的污染有时候也会造成基线波动。有些时候样品里面可能有些保留非常强的组分，可能在色谱柱上很长时间才慢慢被冲出来，这时候已经不是一个峰了，而是基线的干扰或者波动了。

避免这种问题的方法：在每批样品后，用甲醇或者已经长时间冲洗色谱柱。另外，专柱也是一个好的习惯。如果一根se谱柱上作很多不同的样品，也可能导致互相之间的污染和影响。

5．电路的噪音

对于UV检测器来说，就是采样频率不合适而产生的噪音。现在随着超液相的普及，检测器的采样频率也越来越高，有的可以达到80Hz以上。但是如果一味追求高采样频率，可能对灵敏度没有任何帮助，反倒产生比较大的噪音。(我们后面可能会有一起专门检测器的时候，会更详细的讨论这个的原因)

一般来说，我们需要保证一个se谱峰上面有15-20个点，来保证比较平滑的峰形和比较准确的定量结果。如果我的一个峰的时间宽度是0.5min，就是是30s，那只要保证1Hz的采样频率就足够了。如果在UPLC上面，一个峰的时间宽度是0.05min，也就是3s，就需要10Hz以上的采样频率。 那80Hz的采样频率什么时候用呢？ 你的一个峰只有0.5s的时候。

理论上的计算是这样的
N=16（T/W）^2
N是柱效，T是保留时间，W是峰宽。

一般se谱如果柱效12000的塔板数。在5min的时候，出峰宽度大概计算出来时11s。你可以根据计算结果来调整检测器的合适的采样频率。

上面从理论到实践，从各个方面分析的液相色谱基线噪音或者波动的来源，以及相应排除问题的方法，希望大家也能够分享自己的经验。

1. 流动相的在线混合
所有的流动相在线混合都是从方便出发的结果，流动相混合的不充分是基线噪音的一个重要来源，混合方式主要两种：

a. 低压混合：采取时间脉冲的方式，利用比例阀，将不同流动相按一定比例混合。

b. 高压混合：利用多个泵头，控制每个泵的流量，来将流动相按一定比例混合。

在流动相混合后，一般都有一个混合器(Mixer)，来帮助混合的更加充分。从流动相开始混合在一起，到流动相到达色谱柱头，这一段体积叫做延迟体积(Delay Volume)。 Mixer体积越大，混合越好，但是相应延迟体积就越大，造成梯度的延迟。换句话说，就是流动相的变化，需要一定时间后，才能真正到达色谱柱，对分离产生影响。

a. 这个现象在使用UPLC或者UHPLC的时候，会有比较明显的作用。

b. 为什么相同梯度方法，在不同仪器，或者不同品牌的仪器之间转化时，保留时间可能不一样？ 其主要原因就是延迟体积的不同。

在线混合很难做到非常均一的混合效果，这个在示差检测器（RID）上的效果zui明显。这也是为什么示差检测器都要求将流动相预混到一个瓶子里，不能走梯度的原因。

那如何减小因为混合而造成的基线噪音呢？

a. 对于等度的方法，非常简单，预混流动相就可以了。

b. 对于梯度的方法，部分预混流动相也会帮助更好的混合，怎么做呢？看下面的例子。
方法要求乙腈/水比例从10%走到85%。 那可以将流动相A配成10%的乙腈，流动相B配成85%的乙腈，然后A/B梯度从0%走到100%。这就是部分预混。

c. 增大Mixer的体积。一般mixer的体积从几百ul到几个ml都有，在允许的延迟时间下，更换一个体积更大的Mixer，能够有效提高混合的效率。每个色生产厂家的Mixer体积都不一样，基本都可以混用。有碰到过一个Agilent的1100基线噪音大，后来换成1050的mixer就好了，因为1050的mixer比较大一些。
2．液相硬件问题造成的基线噪音
如果液相系统某些地方的工作不正常，也可能造成基线的噪音。

a. 系统有漏。特别是肉眼无法发现的微漏或者泵的内漏，会造成流速的变化和混合比例的变化，从而导致基线噪音。检查的方法就是对系统进行压力测试：将系统从某个地方用死堵堵上，如泵出口，或者自动进样器出口，将压力升高到350bar后停泵，监测压力下降的情况。一般的标准是2-3bar/min的下降是正常水平。或者15%/10min的下降。

b. 梯度比例问题。可以对系统进行一个梯度测试，来检查梯度混合是否准确和一致。将A配成0.1%的丙酮，B是水。在265nm的波长下，将A的比例10%，20%，30%这样一个一个的升高，每个比例走3min。可以根据计算，看每个基线台阶上升是否准确。 也可以从0-100%走一个连续的梯度，看基线上升的平滑性和线性。
3．流动相脱气不好造成的基线噪音
对流动相进行脱气，不仅仅是为了防止系统里面气泡的产生。 流动相脱气越好，基线就会越好。如今zui常用的脱气方式是在线脱气机，但是有的时候脱气并不*。所以当有基线噪音问题是，可以考虑采取多种的脱气方式。
4．系统洁净程度
前面1-3点讲的都是内在原因，造成的基线噪音或者波动。如果你前面的原因都找过了，问题还没有解决，就得考虑一下是不是流动相里面是否有杂质了。如何检查判断是否为流动相的问题呢？

a. 每次更换一种流动相，看基线结果。

b. 重新配置所有流动相。这种方式比较快，但可能无法找到根本原因。

要特别注意在流动相的配置过程中，是否引入了污染，比如使用了不干净的玻璃器皿什么的。更换溶剂的品牌和批次也是方法之一。

色谱柱长期使用造成的污染有时候也会造成基线波动。有些时候样品里面可能有些保留非常强的组分，可能在色谱柱上很长时间才慢慢被冲出来，这时候已经不是一个峰了，而是基线的干扰或者波动了。

避免这种问题的方法：在每批样品后，用甲醇或者已经长时间冲洗色谱柱。另外，专柱也是一个好的习惯。如果一根色谱柱上作很多不同的样品，也可能导致互相之间的污染和影响。
5．电路的噪音
对于UV检测器来说，就是采样频率不合适而产生的噪音。现在随着超液相的普及，检测器的采样频率也越来越高，有的可以达到80Hz以上。但是如果一味追求高采样频率，可能对灵敏度没有任何帮助，反倒产生比较大的噪音。(我们后面可能会有一起专门检测器的时候，会更详细的讨论这个的原因)

一般来说，我们需要保证一个se谱峰上面有15-20个点，来保证比较平滑的峰形和比较准确的定量结果。如果我的一个峰的时间宽度是0.5min，就是是30s，那只要保证1Hz的采样频率就足够了。如果在UPLC上面，一个峰的时间宽度是0.05min，也就是3s，就需要10Hz以上的采样频率。 那80Hz的采样频率什么时候用呢？ 你的一个峰只有0.5s的时候。

理论上的计算是这样的
N=16（T/W）^2
N是柱效，T是保留时间，W是峰宽。

一般色谱如果柱效12000的塔板数。在5min的时候，出峰宽度大概计算出来时11s。你可以根据计算结果来调整检测器的合适的采样频率。

上面从理论到实践，从各个方面分析的液相色谱基线噪音或者波动的来源，以及相应排除问题的方法，希望大家也能够分享自己的经验。