蛋白芯片技术的基本原理与技术的研究现状

随着分子生物学芯片技术研究工作的进一步深入开展，DNA芯片技术已经被逐渐应用于对生物样品中的各种已知或未知的核酸序列表达的检测和比较研究。但是，作为生物体细胞中实施化学反应功能成分的蛋白质，其相当部分与活性基因所表达的mRNA之间未能显示出直接的关系，因此使作为高通量基因表达分析平台的cDNA芯片技术的应用过程受到一定的限制。另外，由于蛋白质结构和构象方面的各种微小的化学变化均能引起活性或功能的改变，为了进一步揭示细胞内各种代谢过程与蛋白质之间的关系以及某些疾病发生的分子水平的机制，必须对蛋白质的功能进行更深入的研究。随着DNA芯片技术的不断成熟以及基因研究所取得的令人瞩目的成果，进一步推动了蛋白质功能的研究及其相关技术的发展，蛋白芯片技术也就应运而生。

蛋白芯片技术的基本原理是将各种蛋白质有序地固定于滴定板、滤膜和载玻片等各种载体上成为检测用的芯片，然后，用标记了特定荧光抗体的蛋白质或其他成分与芯片作用，经漂洗将未能与芯片上的蛋白质互补结合的成分洗去，再利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术，测定芯片上各点的荧光强度，通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质之间相互作用的关系，由此达到测定各种蛋白质功能的目的。为了实现这个目的，首先必须通过一定的方法将蛋白质固定于合适的载体上，同时能够维持蛋白质天然构象，也就是必须防止其变性以维持其原有特定的生物活性。另外，由于生物细胞中蛋白质的多样性和功能的复杂性，开发和建立具有多样品并行处理能力、能够进行快速分析的高通量蛋白芯片技术将有利于简化和加快蛋白质功能研究。

在多年的蛋白芯片技术的研究过程中，研究者为了寻找合适的物质作为蛋白的载体进行了不懈的探索。例如日本学者利用含有阳离子表面活性剂（HTAB）脂质体作为载体，通过戊二醛作用使其与一种铁蛋白包裹外壳的成分结合组装制备成一种纳米水平的装配体，这种装配体可以在适当的pH条件下使铁蛋白分子进入并固定于包裹外壳内面，形成蛋白质的载体。有人利用某些固体表面或覆盖上含有电解质的薄膜作为载体，可以将胶体蛋白质颗粒成分转移至薄膜上形成蛋白芯片。Uetz等在分析啤酒酵母基因组序列全长度阅读框架编码各种蛋白质的相互作用时，使用不同孔数的平板作为载体，建立了约含有6 000个酵母转化株组成的平板蛋白芯片系统，平板上的每一个小孔中含有一个酵母转化株，可以根据其活性功能区开放阅读框架的编码表达生成一种蛋白质，这个系统可以用于蛋白质功能的检测和分析。Arenkov等利用聚丙烯酰胺凝胶板作为支持物，将蛋白样品置于凝胶上，然后经过电泳分离，使其成为蛋白的阵列用于进一步的研究。zui近，哈佛大学蛋白芯片研究中心Gavin等利用制备DNA芯片的高精密度机械手的针状点样枪头在只有显微镜载玻片一半大小的玻片上，制备了第1张含有样品点数为10 800的蛋白芯片。这张芯片用已纯化的蛋白G按每点为1纳升的点样量点样10 799次，另一次用FRB（FK-BRl2—rapamycinbinding domain Of FKBP-rapamycin-associatedprotein）点样。为了确保不同分子量的点样蛋白质都能够被固定在玻片上，他们首先在玻片表面涂上BSA，然后使用N，N，—二琥珀酰胺碳酸（N，N’—disuccinimidyl carbonate）激活BSA表面的赖氨酸、天冬氨酸和*残基成为BSA-NHS玻片，其作用是促进BSA与点样蛋白质的结合而使蛋白质被固定于玻片上。在制备芯片过程中，为了保证被固定在载体上的蛋白质依然保持天然的构象和生物学活性，他们在蛋白质点样的磷酸盐缓冲液中加入40％的甘油，以防止因水分的蒸发而造成蛋白质变性。点样后再经3h的温浴并将芯片浸泡于含有小牛血清蛋白（BSA）的缓冲液中，使芯片表面含有一层小牛血清蛋白，用于封闭与其他蛋白质产生非特异性结合的部位及在表面未参加反应的醛基。为了检测芯片的应用，他们用不同荧光抗体分别标记能与蛋白G和FRB特异结合的IgG和FKBPl2（12Kd FK506—bindingprotein）并作用于蛋白芯片，观察这些蛋白质与蛋白芯片的相互作用，其结果清晰地显示芯片上的蛋白G和单一的FRB点样分别被标上蓝色和红色荧光。该实验研究建立了蛋白质样品微量点样技术并使蛋白质固定于载体上时能够保留原有的构象和生物学活性，这为今后对蛋白质多样品的并行研究或快速分析——为制备高通量功能检测的蛋白芯片奠定了技术基础。