激光扫描共聚焦显维镜定量分析的注意事项

2010年11月24日 09:53:57人气：958来源：上海锐谷生物科技有限公司

《一》制备高特异性和价的荧光抗体

标本只有在用荧光探针标记的前提下才能进行共聚焦显微镜检测．制备高特异性和价的荧光抗体是检测的关键。这就要求选用高质量的荧光素和高特异性与价的免疫血清。同时还要对荧光抗体进行质量鉴定，主要是进行特异性和敏感性鉴定。

《二》标本制作要求

1．标本厚度组织切片或其他标本不能太厚，否则激发光多数消耗在标本下部，而物镜观察的上部不能被充分激发。

2．载玻片载玻片要光洁，无自发荧光；载玻片厚度应在0．8～1．2mm之间，太厚会吸收较多的光，不能使激发光在标本上聚焦。

3．封固剂甘油必须无色透明，无自发荧光。由于荧光在pH 8．5～9．5时较亮，不易很快退去，常用甘油加入0．5mol／lpH 9．0～9．5的碳酸盐缓冲液的等量混合液封片。

《三》定量研究的要求

1．随机性

（1）在感兴趣区域内随机抽样，不能主观地选择一些便于定量的“理想切片”，这种“理想切片”不能代表所要研究的整体区域。

（2）在随机抽取的切片上，应随机抽取观察视野。

（3）在随机抽取的视野中，通过连续观察“光学切片”，得到感兴趣结构的三维定量信息。如果不能连续观察“光学切片”，需要在Z轴方向随机抽样，然后作定量研究。

2．避免参照陷阱如果获得的资料是密度信息，当比较各组参照空间（包含待测结构的区域）的体积不同时，根据密度信息可能得出错误结论。因此，需要注意所谓的参照空间“陷阱”问题。

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