基因常见问题解答

1. 长片段重复。大量的长片段重复很可能会延长基因合成的时间，甚至导致基因*无法合成。
2. 高GC%。基因内部的局部高GC%会严重影响PCR扩增和测序。
3. 二级结构。碱基序列的反转、重叠等会严重影响PCR扩增，在测序时也可能会因此而测不通或信号突然中断等。
4. 测序引物与基因内部的特殊序列结合导致无法正常测序，必须重新设计测序引物。

对策： 对密码子进行优化，尽量减少基因序列中的重复序列,高GC%区和二级结构区。

2.PCR出现非特异性扩增带

1. 引物与靶序列不*互补、或引物聚合形成二聚体。
2. Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多。
3. 酶量过多出现非特异性扩增。

对策：

1. 重新设计引物。
2. 减低酶量或调换另一来源的酶。
3. 降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。
4. 适当提高退火温度或采用二温度点法（93℃变性，65℃左右退火与延伸）。

3.PCR出现片状拖带或涂抹带

1. 酶量过多或酶的质量差。
2. dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多。

对策：

1. 减少酶量，或调换另一来源的酶。
2. 减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度，减少循环次数。

4. DNA没有被限制性内切酶切开或者切割不*

1. 缺少识别序列。
2. 反应条件不合适。
3. 限制性内切酶对DNA甲基化敏感。
4. 内切酶稀释不正确或加入方法不正确。
5. 甘油浓度过高。
6. 限制性内切酶已部分或全部失活。

对策：

1. 检查底物DNA中是否存在可被限制酶识别的DNA序列。
2. 使用随酶提供的反应缓冲液；增大酶量。
3. 检查DNA是否已被甲基化以及所用的限制性内切酶是否对甲基化敏感。
4. 限制性内切酶经稀释缓冲液稀释后应在当天用完；限制性内切酶通常在zui后加入。
5. 更换新酶进行实验。
6. 酶的体积不能超过反应总体积的1/10。

5.电泳后电泳条带扩散，电泳条带移动距离异常

1. 底物DNA不纯。
2. 限制性内切酶不纯。
3. 酶蛋白自身或其它杂蛋白与DNA结合在一起使电泳条带移动距离异常。

对策:

1. 用另外一种限制性内切酶与底物DNA温育作为对照
2. 用产品说明中的底物DNA来检测酶活性，如果电泳后条带仍扩散，说明不正确的操作已使内切酶污染。
3. 电泳前用终浓度为0.1%的SDS在65℃与底物DNA温育10min。

6.连接效率不高

1. 连接缓冲液已变质。
2. 限制性内切酶在连接混合物中仍具活性。
3. 非特异性的核酸酶污染。
4. 连接酶浓度太低。

对策：

1. 用新鲜的连接缓冲液重新进行连接反应。
2. 如果限制性内切酶在65℃温育下热稳定，酶切后应该用酚来去除去蛋白并用乙醇沉淀DNA。
3. 判断连接反应混合物中哪种组分被污染，然后逐一将其替换。
4. 在连接反应中增大连接酶的用量（0.3-0.6 Wu/1μg），并同时使用10%PEG。酶切后用酚抽提底物DNA中的蛋白。

7．质粒及其菌株的运输保存
我们为您提供含有*正确的基因序列的质粒（不少于1ul）、甘油菌（含40%甘油）和穿刺菌各一份。在运输过程中，质粒、甘油菌和穿刺菌均须保证低温运输。在实验室内，穿刺菌应在0～4℃保存；甘油菌应在-70℃以下保存；质粒应在-20℃以下保存，并尽量避免反复冻溶。