抗原的暴露主要采用酶消化或用表面活性剂方法

 

    目前zui常用的酶有*、蛋白酶K、*、*、无花果蛋白酶、*及尿素酶等，另外还有西瓜蛋白酶、苹果蛋白酶和香蕉蛋白酶。其中*、蛋白酶K和无花果蛋白酶消化zui强烈，其次是*、*及*。各种消化酶的具体配制和使用情况如下。

 

    （一）消化酶的配制

 

    1．*

    *较常用，也较易控制，主要用于细胞内抗原的检测。使用的工作浓度一般为0．05％，-0.1％。

    配制方法：称取0．05g或0．1g*和0．05g或0．1g无水氯化钙，加入到100ml蒸馏水中，待溶解后用0．1mol／LNaOH调pH值至7．6。

    消化条件：37℃，10～40min，对某些陈旧的组织可适当延长消化时间。

    注意事项：该酶的*pH为7．6左右，在37℃、钙离子激活的条件下活性*，必须新鲜配制。

 

    2．蛋白酶K

    该酶不仅可用于IHC的抗原暴露，而且常用于TUNEL末端检测和原位杂交（1SH）

前的蛋白和DNA的分离。该酶的一般工作浓度是20ug／ml。

    配制方法：TE缓冲液（0．1mol／LTris—HCl，0．05mol／L EDTA，pH8．0），1ml：100ug／ml蛋白酶K，20。

    消化条件：37℃，消化20min左右。

    注意事项：蛋白酶K（proteinaseK）是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，从林伯白色念珠菌（Trititrachiumalbumlimber）类霉菌中纯化得到。该酶有2个Ca²⁺结合位点，它们离酶的活性中心有一定距离，与催化机理并无直接关系。然而，如果从该酶中除去Ca²⁺，由于出现远程的结构变化，催化活性将丧失80％左右。因此，蛋白酶K的消化作用通常需加入EDTA。

 

    3．*

    常用工作浓度为o．4％。

    配制方法：0．01mol／L HCl，100ml；*（Sigma公司产品），400mg。

    消化条件：37℃，30～180min。

    主要用于细胞间质抗原的显示，另外还可以用于ISH前的消化。配制该酶还可以用0．1％柠檬酸。

 

    4．*

    *是从链球菌（streptomycesgriseas）中分离获得的一种*蛋白酶和酸性蛋白酶的混合物。贮存液浓度20mg／m1，-20℃保存。*反应缓冲液为0．01mol／LTris—HCl（pH7．8），0.01mol／LEDTA和0．5％SDS。常用工作浓度lmg／m1，工作温度37℃。

 

    5．无花果蛋白酶

    其工作浓度基本和*类似，溶在PBS（pH7．4）中即可用于消化，消化条件为37℃，30～60min。

 

    （二）消化酶的选择

    在选择用何种酶消化时，应针对要显示的抗原成分不同而选用不同的酶。一般*和*消化主要用于细胞间质抗原的检测，例如纤连蛋白（fibronectin）、层黏连蛋白（1aminin，LN）和各型胶原的显示；其余酶消化均可用于细胞内抗原的检测。在配制蛋白酶时，应考虑到酶的*pH。例如*的*pH为7．6，要在钙离子的激活下于37℃才能达到*效率；而*则在酸性pH值下才能达到*效率。另外，经酶消化后的切片应充分洗涤，以去除残留的消化酶，否则会对抗体或组织进行缓慢消化，影响抗原抗体的结合，破坏组织结构。阳性和阴性对照片应同时消化，避免人为差异。