大鼠三碘甲状腺原氨酸（T3）ELISA试剂盒的操作步骤及实验原理

实验原理
大鼠三碘甲状腺原氨酸（T3）ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠三碘甲状腺原氨酸（T3）水平。用纯化的大鼠三碘甲状腺原氨酸（T3）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入三碘甲状腺原氨酸（T3），再与HRP标记的三碘甲状腺原氨酸（T3）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过*洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的三碘甲状腺原氨酸（T3）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠三碘甲状腺原氨酸（T3）浓度。
操作步骤
1. 标准品的稀释：大鼠三碘甲状腺原氨酸（T3）ELISA试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
120 ng/ml 5号标准品 150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液
60 ng/ml 4号标准品 150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液
30 ng/ml 3号标准品 150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液
15 ng/ml 2号标准品 150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液
7.5 ng/ml 1号标准品 150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液
2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品zui终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。  
4. 配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用
5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7. 温育：操作同3。
8. 洗涤：操作同5。
9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.
10. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11. 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。