IHC实验热诱导的抗原修复的可能机制

抗原修复（antigen retrieval；AR）是否可能?理论研究上尚未清楚，但是以高温、高压对常规固定石蜡切片进行抗原修复处理的实践表明，可以提高抗原—抗体阳性检测率，同时也可能会出现假阳性，现已广泛应用于免疫组织化学。尤其对原来仅表达在冰冻切片上的抗原，利用AR后极大部分抗体能用于常规甲醛固定的石蜡切片上，这对IHC回顾性研究和临床病理IHC鉴别诊断，肿瘤患者术后的预后检测及疗效评估和各种癌基因蛋白、转录调控因子、细胞凋亡因子等的检测均具有积极的意义。

1、AR的简单回顾

自1893年Ferdinand Blum创立组织固定以来，为了避免甲醛固定对抗原决定簇的影响．许多研究者经过几十年的努力，发现没有一种固定液可对所有的抗原起保护作用，而且形态学保存上远没有甲醛好。为了很好解决这一矛盾，试图将破坏或交联的抗原进行逆转，这一直是从事IHC工作的目标，并进行了很多尝试，例如用酶消化暴露抗原决定簇，但不呈对所有的抗原检测都有效。Shi等（1991）根据20世纪40年代Fraenkel - Conrat等的研究结果，发现甲醛固定可使蛋白发生不同程度的交联，用高温（120~C）或强碱可使交联打开，提出了AR的概念。随后许多研究者的研究结果都证实了高温可使IHC的阳性检测率大大提高，原仅表达在冰冻切片上的大量抗体，都能用于常规甲醛固定的石蜡切片检测。为主Gown（1993）和Boon（1995）分别给予高度的评价，认为是一种新技术的革命和病理学的突破。

目前有关AR的报道文献已超过上千篇，可概括为：理论上研究尚未清楚，但是以高温、高压对常规固定石蜡切片进行AR，可以提高抗原—抗体的阳性检测率，同时也会出现假阳性，其应用范围已超出IHC，例如TUNEL、ISH／FISH和DNA／RNA的三提。

2、抗原修复的可能机制

由于当前对甲醛固定组织会发生什么样的化学反应，尤其是对蛋白质的立体构象会产生什么样的影响尚不十分清楚，因而，导致对抗原修复的机制也不十分清楚。可能的机制可归纳如下三条。*，由于甲醛固定可使蛋白与甲醛、蛋白与蛋白、蛋白与核酸之间通过甲基之桥形成交联，抗原决定簇被遮蔽，可通过高温、盐缓冲液使交联的蛋白水解，断开交联。Beebe等（1999）的实验结果已证实，加温可以水解交联。他们用纯甘油作为抗原修复液，100℃加热10min，IHC检测存档的石蜡切片，结果6种标记物全部为阴性；当在纯甘油中二人10％蒸馏水后，结果在同一张切片上获得了满意的阳性结果。第二种观点认为组织用三醛固定时，会形成蛋白—甲醛—钙复合体，并遮蔽了抗原决定簇，可通过高温使钙离子释放。并与修复液中的钙螯合物—柠檬酸结合，使抗原决定簇暴露，这种假说也得到了实验的三实。Morgan等（1994，1997）用1％CaCiz作为抗原修复液，同样高温修复10min，IHC检测Ki67和血小板反应蛋白为阴性；用o．Olmol／L柠檬酸缓冲液进行抗原修复，获得了阳性结果。第三种观点认为，经甲醛固定后，可形成甲醛化蛋白的三维空间，加热后可恢复蛋三贡自然的三维空间，使抗原得以修复。抗原决定簇又称抗原表位（epitope），是与相应抗体特性结合的部位，决定和控制抗原特异性的特殊化学基团，其抗原蛋白受到甲醛固定而使蛋白质三维结构发生改变，氨基酸侧链上的咪唑和吲哚基团（抗原活性基团）受到遮蔽，而影响抗原—抗体的结合。除了上述三种机制外，可能还存在其他的AR机制。作者认为，在一个具有三维空间结构的天然蛋白质抗原分子中，由于存在于抗原分子表面的抗原决定簇易被抗体分子识别，从分子的立体构型来看，这些抗原决定簇常分布于抗原分子表面突出的位置上，即肽链的转角或末端；而有些抗原决定簇则被抗原分子本身掩盖在、内部，正常情况下不能被抗体分子识别，当用高温加热时，使蛋白质三维空间构象发生改变，使遮蔽的抗原决定簇暴露。这一点可以解释为什么某些抗原在冰冻切片上检测不到，而采用高温处理后，石蜡切片能得到很好地显示。另外，某些非交联剂固定的细胞涂片也用AR，获得了很好的结果。根据实践经验认识到，以上几种修复机理可能同时存在，也可能在不同条件下存在不同AR机理，这可能导致不同抗原检测需不同AR的条件。

原文地址:/biotech/Immunity/2011/r818573923.html