怎么获得染料法荧光PCR的可靠数据

染料法荧光PCR的数据与探针法的相比，除了扩增曲线之外，还增加了熔解曲线分析。如何确定数据是好是坏？好的话，数据可以使用；坏的话，需要查明原因，拟定下一步的体系优化方案。这里探讨如何确定数据是好是坏，如果不好，查明原因，如何拟定下一步的优化方案。

熔解曲线分析

熔解曲线分析是在定量PCR中常用的一种定量测定方法。

原理：由于在PCR定量分析中利用的是在低温复性後，扩增产物会按碱基互补配对原则结合成DNA双链，而有的荧光素在与双链DNA结合产生活化，能产生荧 光效应。但由于反应中存在少量的非特异聚合体（如引物二聚体等），能引起干扰，但非特异聚合体的熔解温度较特异性结合低，当扩增结束後，再缓慢加温，当 DNA变性後，染料被释放，荧光减少，而非特异性结合先于特异性结合减少，对熔解过程进行连续动态监测可得熔解曲线，通过曲线将非特异性讯号和特异性讯号 区分出来，同时对特异性讯号区，荧光减少的快慢与浓度的对数成正比。

目的：减小非特异性结合和引物二聚体的影响。用导数来提高分析率。

用途：除正常测定外，可用来进行突变分析。

方法：1.在扩增完後，缓慢升高温度，同时对荧光进行连续监测，可以得到如下曲线：t1是扩增终点，t2是非特异性结合分离点，t3是DNA开始变性点。

 

2.分析上图可知，t3以後是特异结合分离区，其荧光下降速度与终点扩增的基因成正比，但因为扩增是按等比数列增长，因此实际上是特异结合分离区荧光下降速度与样本含量的对数成正比。由公式可得出标本浓度。

优点：熔解曲线法定量PCR，排除非特异性结合的干扰，提高了测定的准确性和灵敏度，同时还能用于基因突变的分析。（原理：含突变位点的基因结合较正常基因不稳定）

以下面的数据为例，通过熔解曲线和扩增曲线相结合，来介绍染料法荧光PCR数据分析的简单流程。

举例一、选取同一个基因，先看扩增曲线（RN VS CYCLER）：

 

扩增曲线成s 型，形态可以；再看扩增曲线（Delta RN VS CYCLER）：

 

Delta RN VS CYCLER 的扩增曲线形态也是比较标准的；二者都很正常时，再转向熔解曲线， 这时，我们发现熔解曲线不太正常。

 

熔解曲线比较杂乱，有的溶解曲线是双峰，有的熔解曲线是单峰，report 表示，有的tm在85度，有的是在89度。峰的位置也不相同。需要仔细分析，通过复孔，阴性对照等来分析数据。疑问是：产物是否相同？不同Tm的报告是真实的还是仪器的一种误差？

值得提醒的是，不同仪器的report 结果不同，如ABI 的7000系列，只report 主要的tm；；而rotorgene 系列，则会报告每一个小峰的tm。

仔细看每个孔，选取其中正确的熔解曲线：

 

正确的熔解曲线：在某一特定温度处有尖锐的单峰，该峰所在的温度Tm，一般与引物设计及合成时的预测值比较接近。从样本的角度，即采用了什么样得样本，孔 位置的角度（这几个结果好的样本孔是否相连，是否位于扩增仪的同排或者同列的位置），复孔的情况是否相似；操作的角度来进行分析和判断；

正确的熔解曲线的数据，它的CT值是可以用的，可以进行成对的数据分析，如进行Δct分析。

不正确的熔解曲线的数据，要分析形成的原因。

选择熔解曲线结果不好的孔，来分析：

 

这几个孔的熔解曲线出现了双峰，甚至三峰；峰的位置是否相同；结果是否可以认为是类似的原因造成的？ *峰的位置和第二峰的位置是否可以认为是一样的；通过调整程序是否能降低非特异反应？

复孔的情况怎么样：

 

分析所有复孔情况，看结果是否吻合。上图的这个熔解曲线是复孔的熔解曲线，这样可以说明，在一定程度存在非特异扩增的时候，第二峰的tm可能有一定差异；而这是两个相同样本的结果。而熔解曲线结果比较好的时候，复孔的结果也是不错的。

好的熔解曲线和差的熔解曲线放在一起分析：

 

上图中有一对复孔熔解曲线比较好，基本可以认为是单峰；一对复孔熔解曲线出现了双峰；其实仔细看，好的熔解曲线前面也有一个很小很小的峰，位置和不好的双峰是相同的。那么可以认为，差的熔解曲线也出现了特异性产物，虽然前面有一个非特异的峰。

好的熔解曲线和差的熔解曲线放在一起分析，转过来看扩增曲线：

 

经常要对应二者来看的。

再看阴性对照的熔解曲线是正常的，未被污染。再来看熔解曲线：

 

基本上分成两种；好的和不好的；而不好的与好的，在熔解曲线的峰上就分析而言，是吻合的；需要调整程序，降低非特异性扩增；具体表现在程序上，就是提高退火温度，缩短延伸时间。

结论：基本得到目的产物，下一步工作是优化反应程序，提示：提高退火温度，缩短延伸时间；

如果采用统一退火反应条件，对于不好的引物，建议直接重新设计引物，合成，以便得到好的实验结果。

原文地址:/biotech/exp/PCR/2011/h821102252.html