PCR实验技术指南之污染与对策

PCR 反应的zui大特点是具有较大扩增能力与*的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。

1、污染原因

(1)标本间交叉污染：标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染；标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染；有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。

(2)PCR 试剂的污染：主要是由于在PCR 试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR 核酸模板污染。

(3)PCR 扩增产物污染。这是PCR 反应中zui主要zui常见的污染问题。因为PCR 产物拷贝量大(一般为1013 拷贝/ml)，远远高于PCR 检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR 产物污染，就可造成假阳就可形成假阳性。

还有一种容易忽视，zui可能造成PCR 产物污染的形式是气溶胶污染；在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含48000 拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。

(4)实验室中克隆质粒的污染：在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见。因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力。其污染可能性也很大。

2、污染的监测

一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。

对照试验：

(1)阳性对照：在建立PCR 反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR 阳性对照，它是PCR 反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高(100 个拷贝以下)。但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一PCR 试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。

(2)阴性对照：每次PCR 实验务必做阴性对照。它包括①标本对照：被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照；被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。②试剂对照：在PCR 试剂中不加模板DNA 或RNA，进行PCR 扩增，以监测试剂是否污染。

(3)重复性试验

(4)选择不同区域的引物进行PCR 扩增

3、防止污染的方法

(1)合理分隔实验室：将样品的处理、配制PCR 反应液、PCR 循环扩增及PCR 产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR 产物的鉴定应与其它步骤严格分开。能划分①标本处理区；②PCR 反应液制备区；③PCR 循环扩增区；④PCR 产物鉴定区。 其实验用品及吸样枪应。实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA 或RNA。

(2)吸样枪：吸样枪污染是一个值得注意的问题。由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。

(3)预混和分装PCR 试剂：所有的PCR 试剂都应小量分装，如有可能，PCR 反应液应预先配制好，然后小量分装，-20℃保存。以减少重复加样次数，避免污染机会。另外，PCR 试剂，PCR 反应液应与样品及PCR 产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。

(4)防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用。

(5)设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的zui低量的标准病原体核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照。

(6)减少PCR 循环次数，只要PCR 产物达到检测水平就适可而止。

(7)选择质量好的Eppendorf 管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出。

4、PCR 污染解决对策

PCR 检测微量感染因子时，一定要注意产物残留污染的问题。

(1)污染的预防：进行PCR 操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，zui大程度地降低可能出现的PCR 污染或杜绝污染的出现。

(2)划分操作区：目前，普通PCR 尚不能做到单人单管，实现*闭管操作，但无论是否能够达到单人单管，均要求实验操作在三个不同的区域内进行，PCR 的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行：

a、标本处理区，包括扩增摸板的制备；

b、PCR 扩增区，包括反应液的配制和PCR 扩增；

c、产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。

各工作区要有一定的隔离，操作器材，要有一定的方向性。如：标本制备→PCR扩增，产物分析，产物处理。

切记：产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。

(3)分装试剂：PCR 扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装。所有的加样器和吸头需固定放于其中，不能用来吸取扩增后的DNA 和其他来源的DNA：

a、PCR 用水应为高压的双蒸水；

b、引物和dNTP 用高压的双蒸水在无PCR 扩增产物区配制；

c、引物和dNTP 应分装储存，分装时应标明时间，以备发生污染时查找原因。

(三) 实验操作注意事项尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意：

a、戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套；

b、使用一次性吸头，严禁与PCR 产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染；

c、避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面；

d、操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的度；

e、zui后加入反应模板，加入后盖紧反应管；

f、操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR 反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性；

g、尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器zui容易受产物气溶胶或标本DNA 的污染，使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器，至少PCR操作过程中加样器应该，不能交叉使用，尤其是PCR 产物分析所用加样器不能拿到其它两个区；

h、重复实验，验证结果，慎下结论。

5、追踪污染源

如果不慎发生污染情况，应从下面几条出发，逐一分析，排除污染。

(1)设立阴阳性对照：有利于监测反应体系各成分的污染情况。选择阳性对照时，应选择扩增弱，且重复性好的样品，因强阳性对照可产生大量不必要的扩增序列，反而可能成为潜在的污染源。如果以含靶序列的重组质粒为对照，100 个拷贝之内的靶序列就足以产生阳性扩增。阴性对照的选择亦要慎重，因为PCR 敏感性*，可以从其它方法(Sourthern 印迹或点杂交等)检测阴性的标本中检测出极微量的靶分子。此外，每次扩增均应包括PCR 体系中各试剂的时机对照，即包括PCR 反应所需的全部成分，而不加模板DNA，这对监测试剂中PCR 产物残留污染是非常有益的。如果扩增结果中试剂对照为阳性结果，就是某一种或数种试剂被污染了。此时，要全部更换一批新的试剂进行扩增，扩增时设立不同的反应管，每一管含有一种被检测试剂，在检出污染试剂后，应马上处理。

(2)环境污染：在排除试剂污染的可能性外，更换试剂后，若不久又发现试剂被污染了，如果预防措施比较严密，则考虑可能为环境污染。

环境污染中常见的污染源主要有：

a、模板提取时真空抽干装置；

b、凝胶电泳加样器；

c、电泳装置；

d、紫外分析仪；

e、切胶用刀或*片；

f、离心机；

g、冰箱门把手，冷冻架，门把手或实验台面等；此时可用擦拭实验来查找可疑污染源。1)用无菌水浸泡过的灭菌棉签擦拭可疑污染源；2)0。1ml 去离子水浸泡；3)取5ml 做PCR 实验；4)电泳检测结果。

h、气溶胶。如果经过上述追踪实验，仍不能查找到确切污染源，则污染可能是由空气中PCR 产物的气溶胶造成的，此时就应该更换实验场所，若条件不允许，则重新设计新的引物(与原引物无相关性)。

6、污染处理

(1)环境污染

a、稀酸处理法：对可疑器具用1mol/L 盐酸擦拭或浸泡，使残余DNA 脱嘌呤；

b、紫外照射(UV)法：紫外波长(nm)一般选择254/300nm，照射30min 即可。需要注意的是，选择UV 作为消除残留PCR 产物污染时，要考虑PCR 产物的长度与产物序列中碱基的分布，UV 照射仅对500bp 以上长片段有效，对短片段效果不大。UV 照射时，PCR产物中嘧啶碱基会形成二聚体，这些二聚体可使延伸终止，但并不是DNA 链中所有嘧啶均能形成二聚体，且UV 照射还可使二聚体断裂。形成二聚体的程度取决于UV 波长，嘧啶二聚体的类型及与二聚体位点相邻核苷酸的序列。在受照射的长DNA 链上，形成二聚体缺陷的数量少于0。065/碱基，其他非二聚体的光照损伤(如环丁烷型嘧啶复合体，胸腺嘧啶乙二醇，DNA 链间与链内的交联和DNA 断裂等)均可终止Taq DNA 聚合酶的延伸。这些位点的数量与二聚体位点相当。如果这些位点( 0。13/碱基)在DNA 分子上随机分布，一个500bp片段的DNA 分子链上将有32 处损伤位点，那么，105个这样的分子中每个分子中会至少有一处损伤。相反，如果100bp 的片段，每条链上仅有6 处损伤，105个拷贝分子中将有许多分子没有任何损伤。这就是UV 照射有一定的片段长度限制的原因。

(2)反应液污染

可采用下列方法之一处理：

a、DNase I 法：PCR 混合液(未加模板和Taq 聚合酶)加入0。5U DNase I，室温反应30min 后加热灭活，然后加入模板和Taq 聚合酶进行正常PCR 扩增。该方法的优点是不需要知道污染DNA 的序列；

b、内切酶法：选择识别4 个碱基的内切酶(如Msp I 和Taq I 等)，可同时选择几种，以克服用一种酶只能识别特定序列的缺陷，室温作用1h 后加热灭活进行PCR；

c、紫外照射法：未加模板和Taq 聚合酶的PCR 混合液进行紫外照射，注意事项与方法同上述UV 照射法；

d、g 射线辐射法：1。5kGy 的辐射可*破坏0。1ng 基因组DNA，2。0 kGy 可破坏104 拷贝的质粒分子，4。0 kGy 仍不影响PCR，但高于此限度会使PCR 扩增效率下降。引物可受照射而不影响PCR，g 射线是通过水的离子化产生自由基来破坏DNA 的。

e、*糖苷酶(UNG)法：由于UV 照射的去污染作用对500bp 以下的片段效果不好，而临床用于检测的PCR 扩增片段通常为300bp 左右，因此UNG 的预防作用日益受到重视和肯定。原理：在PCR 产物或引物中用dU 代替dT。这种dU 化的PCR 产物与UNG 一起孵育，因UDG 可裂解*碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去dU 而阻止TaqDNA 聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG 对不含dU 的模板无任何影响。UNG 可从单或双链DNA 中消除*，而对RNA 中的*和单一*分子则无任何作用。

f、dUTP 法：用dUTP 代替dTTP，使产物中掺入大量dU。在再次进行PCR 扩增前，用UNG 处理PCR 混合液即可消除PCR 产物的残留污染。由于UNG 在PCR 循环中的变性一步便可被灭活，因此不会影响含dU 的新的PCR 产物。

g、dU 引物法：合成引物时以dU 代dT，这样PCR 产物中仅5ˊ端带dU。UNG 处理后，引物失去了结合位点而不能扩增。对长片段(1-2kb 以上)的扩增用dUTP 法效率较用dTTP低，而用dU 法就可克服这一缺点。dU 引物将dU 设计在3ˊ端或近ˊ端。该法仅能用于引物以外试剂的处理。优点：可以去除任何来源的污染；UNG 处理可以和PCR 扩增在同一个反应管内进行；由于扩增产物中有大量dU 存在，可*消除污染源。需注意的是掺入dUTP 的DNA不应对产物的任何操作有影响，在进行PCR 产物克隆时，应该转化UNG-(UNG 缺陷)大肠杆菌受体菌，否则转化产物会被受体菌UNG 消化掉。

h、固相捕获法：用于去除标本中污染的核酸和杂质，原理如下：1)用一*标记的单链RNA 探针与待扩核酸杂交，杂交区域是非扩增区；2)用包被链霉亲和素的固相载体来捕获带有*探针的杂交核酸，通过漂洗可去除污染的扩增产物和杂质；3)洗脱靶分子后用特异引物扩增非RNA 探针杂交区域。第2)步的漂洗后可用PCR 检测以确定标本是否被扩增产物或重组质粒污染。

i、RS-PCR 法(RNA-specific PCR)：也称为链特异性PCR，主要指用于RNA 模板的特异性PCR 法，该法可明显降低假阳性而不影响PCR 的敏感性。其关键在于设计引物，逆转录引物的3ˊ端(A 区)有2 0 个核苷酸左右为模板的特异性互不序列，5ˊ端2 0 个核苷酸(C 区)为附加修饰碱基。与mRNA逆转录后，经超速离心使cDNA 与多余引物分开，再用和第二引物(C)以*链cDNA为模板合成第二链cDNA，以后的PCR 循环中用逆转录引物的B 区和引物C 进行扩增加尾cDNA，而污染的DNA 或质粒DNA 才不会被扩增。

j、抗污染引物法：该对引物扩增时通过病毒DNA克隆如入质粒的位点。这一区域只存在完整的原病毒中，在重组质粒中，这一区域分成两个区域与克隆位点被。如果重组质粒污染了标本，也不能扩增出任何条带，即使出现了扩增带，其大小也与预期的不同。只有原病毒DNA 才能被引物扩增，因此只要出现预期大小的扩增带就可以证明标本是阳性的，该法试用于环状靶分子系列。

附录： 各种碱基符号

在设计简并引物或测序时你可能会碰到这样的符号来表示碱基，到时候不要不知道哦：

B = C or G or T

D = A or G or T

H = A or C or T

K = G or T

M = A or C

N = A or C or G or T

R = A or G

S = C or G

V = A or C or G

W = A or T

Y = C or T