ELISA显色和比色

ELISA显色和比色

1：显色

显色是 ELISA中的zui后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴 性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。在定量测定中，加入底物后的反应温度和时 间应按规定力求准确。定性测定的显色可在室温进行，时间一般不需要严格控制，有时可根据阳性对照孔和阴性对照孔的显色情况适当缩 短或延长反应时间，及时判断。

OPD底物显色一般在室外温或37℃反应20-30分钟后即不再加深，再延长反应时间，可使本底值增高。OPD底物液受光照会自 行变色，显色反应应避光进行，显色反应结束时加入终止液终止反应。OPD产物用硫酸终止后，显色由橙黄色转向棕黄色。

TMB受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。T MB经HRP作用后，约40分钟显色达，随即逐渐减弱，至2小时后即可*消退至无色。TMB的终止液有多种，叠氮钠和十二 烷基硫酸钠（SDS）等酶抑制剂均可使反应终止。这类终止剂尚能使蓝色维持较长时间（12-24小时）不褪，是目视判断的良好终 止剂。此外，各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长（450nm）测读吸光值。

2：比色

比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。以软板为载体的试验，需先将板置于标准96孔的座架中，才可进行比色。在加底物液显色前，先将软板边缘剪净，这样，此板就可*平妥坐入座架中。

比色时应先以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔），以 记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行计算。

比色结果的表达以往通用光密度（oplical density，OD），现按规定用吸光度（absorbence，A），两者含义相同。通常的表示方法是，将吸收波长写于A字 母的右下角，如OPD的吸收波长为492nm，表示方法为"A492nm"或"OD492nm"。

3：酶标比色仪

酶标比色仪简称酶标仪，通常指于测读 ELISA结果吸光度的光度计。针对固相载体形式的不同，各有特制的适用于板、珠和小试管的设计。许多试剂公司配套供应酶标仪。 酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可到0.0 01，准确性为±1%，重复性达0.5%。举例说，若某孔测得的A值为1.083，则该孔相对于空气的真实A值应为1.083± 0.01（1.073~1.093），重复测定数次，其A值均应1.083±0.05（1.078~1.088）在之间。酶标仪 的可测范围视各酶标仪的性能而不同。普通的酶标仪在0.000~2.000，新型号的酶标仪上限拓宽达2.900，甚至更高。超 出可测上限的A值常以"*"或"over"或其它符号表示。应注意可测范围与线性范围的不同，线性范围常小于可测范围，比如某一 酶标仪的可测范围为0.000~2.900，而其线性范围仅0.000~2.000，这在定量ELISA中制作标准曲线时应予注 意。

酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，操作时室温宜在15~30℃，使用前先预热仪器
15-30分钟，测读结果更稳定。

测读 A值时，要选用产物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波长。有的酶标仪可用双波长式测读，即每孔先后测读两次，*次在zui适波 长（W1），第二次在不敏感波长（W2），两次测定间不移动ELISA板的位置。例如OPD用492nm为W1，630nm为W 2，zui终测得的A值为两者之差（W1-W2）。双波长式测读可减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。

各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细看说明书。

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