腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性试剂盒

【资料简介】

腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性试剂盒
腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase，AGP）活性测定试剂盒说明书

分光光度法 25 管/24 样

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义

AGP (EC 2.7.7.21)主要存在于植物中，催化葡萄糖-1-磷酸与 ATP 反应生成淀粉合成的直接前体 ADPG，是植物淀粉生物合成的主要限速步骤。
腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性试剂盒测定原理

AGP 催化的逆向反应生成 G1P，在反应体系中添加的磷酸己糖变位酶和 6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化生成 6-磷酸葡萄糖酸和 NADPH，340nm 下测定 NADPH 增加速率，即可计算

AGP 活性。

需自备的的仪器和用品

紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水
试剂的组成和配制

提取液：液体 30mL×1 瓶，4℃保存;
试剂一：液体 10mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1 支，4℃保存；临用前加入 250μL 蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入 2mL 蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入 3mL 蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
试剂五：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 3mL 蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存；临用前加入 250μL 蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
试剂七：粉剂×1 支，-20℃保存；临用前加入 250μL 蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

粗酶液制备

按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、试剂一置 30℃保温 10min 以上。

2、在 EP 管中按顺序加入下列试剂（如果一次性测定样本较多，可以将试剂一、二、三和四按比例配成混合液 1，将试剂一、五、六和七按比例配成混合液 2）

试剂名称（μL）    测定管
    
试剂一    100
    
试剂二    10
试剂三    50
试剂四    100
样本    20

混匀，30℃保温 15 min，置沸水浴中 1 min（盖紧，防止水分散失），冰浴迅速冷却

试剂一    300
试剂五    100
试剂六    10
试剂七    10

混匀后立即在 340 nm 波长下记录初始吸光度 A1 和 2min 后的吸光度 A2，计算 ΔA=A2-A1。

AGP 活性计算

腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性试剂盒1、按样本蛋白蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活性单位。

AGP（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T

=2813×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。2、按照样本鲜重计算

单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

AGP（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（W× V 样÷V 样总）÷T

=2813×ΔA÷W

V 反总：反应体系总体积，7×10-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103mol/L/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.02 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量。