小鼠腹腔巨噬细胞原代培养实验

【资料简介】

实验方法原理 
巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周，多用做原代培养，难以长期生存。
实验材料 小鼠
试剂、试剂盒 RPMI1640培养基酚红酒精小牛血清巯基乙醇酸钠双抗培养液小牛血清青霉素链霉素台盼兰酒
仪器、耗材 绵球手术直剪注射器培养皿超净台解剖板眼科剪离心管眼科镊
实验步骤 
一、实验材料准备
 
1.   动物：各个品系的小鼠2-4只。
 
2.  试剂：RPMI1640培养基(含酚红)，小牛血清，双抗，培养液(10%小牛血清、RPMI1640、双抗)，台盼兰等。酒绵球和酒精绵球。
 
3.  器械：一次性注射器、手术器械。
 
二、实验方法
 
如果采用刺激物，则可在实验前三天腹腔注射3%巯基乙醇酸钠每只2 mL，获得的巨噬细胞数要多一些。不采用刺激物，直接开始下面的步骤。
 
1.  拉颈处死小鼠，在75%酒精浸泡1-2分钟，移入超净台中，仰卧位固定于解剖板上，酒消毒腹部皮肤，酒精绵球脱。用手术直剪充分剪开腹部皮肤，暴露腹部肌层，再用酒精绵球消毒腹部肌层。
 
2.   用注射器抽取5 mL含双抗的RPMI1640培养基注入腹腔，用绵球轻揉腹部1-2 min，然后，用眼科镊稍提起腹腔，并用眼科剪剪开一个小口，用吸管吸取细胞悬液，移入离心管中(个人认为，此法比用注射器抽吸好一些)。
 
3.  1 000 rpm离心5 min后，用含双抗的RPMI1640培养基洗涤一次，再次离心，重悬细胞于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，如果是作为饲养细胞使用，则选择相应的培养液。台盼蓝拒染法计数，将细胞稀释到目的浓度后，接种即可。
 
4.  如果是作为饲养细胞使用，调整浓度至2x105个/mL，接种到96孔板中，每孔100-200 uL；如果作为其它实验使用，可以调整成2x106/mL，加到24孔平底培养板中，1 mL/孔；5% CO2温箱孵育2 h后，换液，并用RPMI1640培养基洗1-2次，弃去未粘附细胞，贴壁细胞为单层的巨噬细胞。
 
三、 结果
 
巨噬细胞刚贴壁时偏圆形，或者类似鹅卵石形状，然后慢慢伸出伪足，铺开呈三角形或多角形。巨噬细胞有吞噬的特性，当与细菌混合在一起的时候，在40倍物镜下可以看到巨噬细胞吞噬细菌，因此，巨噬细胞作为饲养细胞可以清除部分污染的细菌、支原体和部分细胞碎片。
 
 
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注意事项 
1.  巨噬细胞是终末分化细胞，不会增殖。

2.  很难消化下来，所以接种的时候，必须直接接种到目的培养器皿中。
 
3.  严格无菌操作，在超净台内进行。

4.  为避免交叉感染，每一只小鼠更换注射器。

5.  吸管吸取细胞悬液的时候，尽量不要吸到大小肠，否则容易引起成纤维细胞污染。
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其他 
巨噬细胞刚贴壁时偏圆形，或者类似鹅卵石形状，然后慢慢伸出伪足，铺开呈三角形或多角形。巨噬细胞有吞噬的特性，当与细菌混合在一起的时候，在40倍物镜下可以看到巨噬细胞吞噬细菌，因此，巨噬细胞作为饲养细胞可以清除部分污染的细菌、支原体和部分细胞碎片。