蛋白质的生物合成标记实验

【资料简介】

实验材料    蛋白质
试剂、试剂盒    *PBS
仪器、耗材    培养箱离心管
实验步骤    
1.  培养悬浮细胞至对数增*，室温300 g 离心5 min。回收107~108细胞。
 
2.  每2×107细胞用约10 ml 37℃的短时间标记培养基在圆锥型试管中洗涤，于室温300 g 离心5 min 回收细胞，小心重悬细胞并重复洗涤过程。

3.  以37℃的短时间标记培养基重悬至5×106细胞/ml，于37℃保温15 min 以耗尽细胞内的甲硫氮酸，间歇摇动。

4.  室温解冻［35S］*，并用37℃短时间标记培养基来配制含0.1~0.2 mCi/ml 的工作液。
 
5.  室温300 g 离心5 min，回收细胞，每2×107细胞以4 ml［35S］工作液重悬于圆锥试管。37℃水浴保温30 min~3 h，频繁翻覆试管以混悬细胞。

6.  4℃ 300 g 离心回收细胞，小心重悬于10 min 冰冷PBS缓冲液，重复离心操作。

7.  必要时，用TCA沉淀法确定放射性标记的掺入量，按免疫亲和层析、免疫沉淀法和单向和双向凝胶电泳处理和分析细胞。
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注意事项    
1.  在标记过程，会释放挥发性的［35S］化合物，在使用前须把过于37℃水浴的［35S］*紧紧密封，不要在37℃放置超过30 min。

2.  培养液和冼涤液具放射性，须遵循放射性物质的使用和丢弃的安全守则进行。
实验材料    细胞
试剂、试剂盒    PBS*
仪器、耗材    培养箱离心机
实验步骤    
1.  在100 mm 直径的培养皿上培养贴壁细胞（0.5~2×107）至70%~90%汇片，吸去培养液，用10 ml 于37℃短时间标记培养基轻轻搖晃冼两次细胞。

2.  加入5 ml 于37℃短时间标记培养基，在5%CO2的加湿培养箱于37℃温育15 min，以耗尽细胞内的*。

3.  制备［35S］*工作液。

4.  除去细胞上的培养液，加入2~4 ml ［35S］*工作液，在5%CO2的加湿培养箱于37℃温育30 min~3 h。

5.  除去细胞上的培养液，用10 冰冷PBS缓冲液洗细胞1次后弃去，加入10 ml 冰冷PBS刮下培养皿上的细胞。
 
6.  将细胞悬液移至15 ml 圆锥试管，于4℃ 300 g 离心5 min，弃上清。

7.  处理和分析细胞。

实验材料    细胞
试剂、试剂盒    *PBS
仪器、耗材    离心机培养箱
实验步骤    
1.  准备和用［35S］*标记细胞，用0.2~1 mCi/ml 的［35S］甲疏氨酸脉冲标记细胞5~30 min。
 
2.  脉冲标记后，除去［35S］*培养基，用10 ml 于37℃追加培养基冼细胞1次，加入10 ml 追加培养基继续培养。
 
3.  在37℃温育至设定时间。悬浮培养细胞在盖紧盖子的试管中旋转温育，贴附培养细胞在37℃ 5%CO2的加湿培养箱中培养。
 
4.  于4 ℃300 g 离心收集悬浮培养细胞，弃上清。

5.  刮下贴附培养细胞，并移入15 ml 圆锥试管，300 g 离心5 min，弃上清。用10 ml 冰冷PBS缓冲液洗1次，重复离心。

6.  处理及分析细胞。