核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒说明书下载

【资料简介】

核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒(Nuclear-Cytosol Extraction Kit ) 
 
描述：本试剂盒用于从哺乳动物组织和培养细胞中提取核蛋白和/或胞质蛋白，提取制备过程简便。制备的
核蛋白和胞浆蛋白能保持天然活性，并且纯度较高。提取的蛋白特别适于转录因子活性分析、凝胶阻滞实
验(gel shift assay, EMSA)、免疫共沉淀、酶活性测定，也适于 Western Blot 实验。  
 
核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒(Nuclear-Cytosol Extraction Kit ) 组份 
Kit compositions  50 extractions  100 extractions  Storage 
Cytosol Extraction Buffer A (CEB-A)  25 ml    50 ml  4 
o
C, 1 year 
Cytosol Extraction Buffer B (CEB-B)  1.5 ml  2×1.5 ml  4 
o
C, 1 year 
Nuclear Extraction Buffer (NEB)  5 ml  10 ml  4 
o
C, 1 year 
注意：不含蛋白酶抑制剂成分 
 
实验的一般考虑 
1.  所有的操作都应在冰浴中进行，  所有的试剂在实验前都要预冷。 
2.  根据大致的细胞数，或者根据离心后的细胞体积(Packed cell volume, PCV)，估计试剂加入的量。PCV
因细胞类型不同而有所差异。细胞数、PCV和加入试剂的关系参见下表： 
培养皿直径  35 mm or  或 1 孔六孔板  60 mm  10 cm 
培养皿面积  10 cm2
  30 cm2
  75 cm2
 
估计细胞数量  5 ×105
  1 ×106
  5 ×106
 
估计 PCV(μl)  5  10~20  50~100 
加入 CEB-A (μl)  25  50~100  300~500 
加入 CEB-B (μl)  1.2~1.5  3~6  3~6 
加入 NEB (μl)  5~10  20  100 
 
操作步骤 
1.  裂解：(1)  培养细胞，PBS 洗涤细胞两次，估计大致的细胞数，或者估计离心后的细胞体积 PCV。每
1 ×106
个细胞加入 50~100μl 的 CEB-A，刮下细胞转移至预冷的 1.5ml 离心管；或者每体积 PCV细胞
加入 5 倍 PCV 体积的 CEB-A (即 10~20 μl PCV的细胞加 50~100μl 的 CEB-A)，剧烈振荡重悬。(2) 组
织样本，称重后剪成小块，PBS 洗涤两次。通常每 10 mg 动物组织相当于 1×106
个细胞，需加入
50~100μl CEB-A，可根据组织重量按比例加入。在冰上用玻璃匀浆器或高速粉碎器破碎组织或细胞。
使用玻璃匀浆器通常需要 20~40 次上下抽动匀浆。 
2.  裂解产物转移至预冷的 1.5ml 离心管，剧烈振荡 30 秒，冰浴10~15min，期间每 5 分钟振荡 15 秒。 
3.  根据裂解物体积加入 1/20 体积的 CEB-B，振荡 10 秒，冰浴1min (加入 CEB-B 可去除核膜，适于制备
高纯度的核蛋白，但可使胞浆蛋白出现很少量的膜蛋白污染，欲制备高纯胞浆蛋白可省略此步骤)。 
4.  1000g 4 o
C 离心 5 分钟，沉淀即是核粗提物，上清则是粗制的胞浆蛋白组分。 
5.  胞浆组分制备：将上清转入另一预冷的离心管，12000g 4 o
C 离心，弃沉淀，取上清即得胞质蛋白组分，
于−20~−70ºC 保存。 
6.  核粗提物处理：取第步骤 4 的核粗提物沉淀，加入 100μl CEB-A和 5 μl CEB-B 振荡10 秒洗涤沉淀，
冰浴 1min，1000g 5min 弃上清。再次加入 100μl CEB-A和 5 μl CEB-B 重复此步骤。 
7.  核蛋白制备：在离心沉淀物（细胞核）中加入 50~100μl 预冷的 NEB (可选：使用前每 ml NEB 加入 1μL 
DTT，5μL PMSF，5μl 蛋白酶抑制剂)，剧烈振荡 15 秒，冰上30min，期间每 10 min 振荡 15 秒。12000g 
5min，上清液含核蛋白成分，其中含有 25%的甘油；转入新管−20~−70ºC 保存。 
8.  只需对提取的胞质组分进行蛋白定量(Braford或 BCA法)，核蛋白纯度高但含量低，无需定量。 
 
核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒(Nuclear-Cytosol Extraction Kit ) 说明：按照说明书操作，每 106
个细胞可得到 50-75μg 蛋白。试剂盒在不加入蛋白酶抑制剂时仍然工作良
好，但用户可自行加入。裂解时间是重要的，过短则细胞裂解不全导致蛋白产率低，裂解时间长则导致胞
浆蛋白有核蛋白污染。上述制备的蛋白样品与 2x SDS-PAGE 混合即可上样电泳。 
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