活化微珠的交连

抗体与固相基质共价结合的另一种常用方法是利用多种化学试剂使微珠活化，然后将纯化的抗体与活化的微珠结合。这种方法有许多优点，通常可以在超越蛋白质能够耐受的苛刻条件下使微珠活化，因此可以采用很多激活方法。此外，许多结合方法形成的交连，在范围广泛的变性条件下仍保持稳定。另一个优点是许多活性微珠有商品出售。总的说来，商品化的微珠为免疫亲和纯化提供了较好的活化微珠。
1．准备工作
应用抗体柱对各种蛋白质进行亲和纯化的主要特点是在足够温和的条件下就能将抗原从层析柱上洗脱，并能保持蛋白质的结构和／或功能不改变。洗脱的难易是由连接抗原与抗体之间结合键的类型和数量决定的。在制备大规模层析柱用于纯化之前，有必要对所有可利用的抗体进行测试，从中选择适当的抗体制备亲和层析柱。
所制备的抗体缓冲液中不应含有无关的化合物，因其可通过反应基团结合到活性微珠上，这种结合反应很可能就发生在抗体的氨基（或巯基）上。如果这些化合物是在抗体纯化时使用，所制备的抗体必须对0．5mol／LPBS（pH7，5）结合缓冲液充分透析。
2．所需溶液、试剂和特殊设备
纯化的抗体； 0．5mmol／L磷酸钠（pH7．5）； 含1mol／LNaCi的0．05mol／L磷酸钠溶液（pH7．5）； 100mmol／L乙醇胺（pH7．5） 摇床。
3．操作步骤
（1）用0．5mol／L（pH7．5）的磷酸钠溶液将抗体配成所需浓度。留少量样品供测定结合效率用。每次实验用于结合的抗体的量都不相同。在大多数实验中每毫升微珠内加10mg抗体可得到较高容量层析柱。
（2）加入按产品使用说明制备的活化的微珠
（3）置摇床上轻轻混合放室温过夜。
（4）用0．5mol／L磷酸钠（pH7．5）洗涤微珠2次。留取结合过夜的上清， 比较结合前、后样本中的蛋白含量。
（5）用含1mol／LNaCl的0．05mol／L磷酸钠溶液（PBS，pH7．5）洗涤微珠1次。
（6）加10倍体积的100retool／L乙醇胺（pH7．5）室温下孵育4h或过夜，振荡。
（7）用PBS洗涤2次，加入0．01％硫柳汞，免疫微珠可置4C贮存，数月内保持稳定。
制备好的微珠即呵用于抗原的免疫亲和纯化
常见问题
将抗体有效地结合到活性微珠上虽是——项简单的工作，但保持抗体的活性常很困难。抗体失活大多是由于抗体与微珠过度偶联，或偶联发生在抗体的抗原识别区。这两种结果都会使抗体—微珠基质结合抗原的能力显著低于未偶联的同量抗体。保持10％-50％的结合活性较为常见，并可认为是活性良好水平。在偶联过程中，如果抗体的活性远远低于这一水平，可采取下列三种措施保持抗体活性。
*种控制失活的重要方法是在广泛偶联之前终止反应，偶联率可以在开始实验前测定。当不到50％的抗体结合时即停止反应，未结合的抗体不会受到损害，可以在其他实验中再使用，及早终止反应可以控制每种抗体通过许多不同位点偶联。终止结合反应的恰当时间可通过一个小规模的不同作用时间来确定。未偶联的抗体可通过SDS隅聚丙烯酰胺凝胶电泳，和考马斯亮蓝染色来测定重链和轻链条带。
第二种防止过度偶联的方法是调整反应的pH值以减慢偶联速度。大多数偶联方法是通过抗体上的氨基连接，而氨基基团的反应对pH值较敏感。如果抗体偶联的pH值低于氨基基团的pK值，大多数氨基基团在任何时候都不会发生偶联，这样就控制了过度偶联率。下述方法采用中性的pH值，有助于这一问题的解决。如果仍然出现过度偶联，可以试用略低的pH值。选用合适的pH值需凭经验通过多次试验才能确定，不同的抗体所需的条件也不一样。可以采用逐渐降低pH值单位（如0．5）的方式来测试新的实验条件。另一方面，如果出现太低的偶联率，可以增加缓冲液的pH值，延长偶联时间。pH值在8．2以上时，可用0．5mol／L碳酸盐缓冲液代替磷酸盐缓冲液。
第三种减少过度偶联问题的方法是将其他氨基基团引入抗体偶联反应。在预备试验时，用不同浓度的带有一级氨基基团的小分子物质阻断抗体结合到微珠上。2种zui常用的化合物是乙醇胺和*。从中选一个适当浓度的封闭剂使偶联过程中只有约10％的抗体结合。选择一个合理的起始浓度，建议抗体的zui终浓度不超过10mg／m1湿微珠。
zui后，所用的抗体可能有一个氨基基团是分布在抗原结合位点内。这个位点与大多数活性微珠结合后特别容易失活。如果在偶联反应中，抗原结合能力不断丧失，可改用蛋白A或蛋白G微珠，以及使用不依赖于氨基基团的双功能交联剂进行偶联。