抗体／蛋白A或／蛋白G微珠层析柱制备的操作方法

1．准备工作
应用抗体柱对各种蛋白质进行亲和纯化的zui主要特点是在足够温和的条件厂就能将抗原从柱上洗脱下来，并能保持蛋白质的结构和／或功能不改变。连接抗原和抗体的结合键的类型和数量是决定洗脱难易的关键。在制备大规模层析柱用于纯化之前，有必要对所有可利用的抗体进行测试，并从中选择适当的抗体制备亲和层析柱。
建议不应将抗体流经含有微珠的层析柱，因为这样会使抗体形成·个浓度梯度，从析柱1：而的浓度高，而下面的浓度低。为避免这种情况，应将抗体与微珠混合成泥浆状而使其结合。
2．所需的溶液、试剂和特殊设备
抗体；蛋白A或蛋白G微珠；0．2mol／ml硼酸钠（pH9．0）；二甲基庚二酸（DMP）；PBS；0．2mol／L乙醇胺（pH8．0）；考马斯亮蓝；Laemmli样品缓冲液；摇床。
3。操作步骤
（1）将抗体与蛋白A或蛋白G微珠结合，一般使用的层析柱，每毫升湿的微珠大约可结合2mg的抗体。将抗体与蛋白A／G微珠混合，使其成为一种稀薄的浆状。在10ml溶液总量中大约含lml微珠。轻轻振荡混匀，室温孵育1h。
如前所述，免疫亲和层析柱一般用单抗或经过亲和纯化的多抗制备。可以用不同来源的抗体，包括杂交瘤细胞培养上清液、腹水或纯化的抗体溶液， 由于与蛋白A／G微珠结合，可作为去除贮存缓冲液或交换缓冲液中其他物质的步骤。
如果需知道与微珠结合抗体的准确浓度，在与微珠结合之前应对抗体进行纯化。
（2）用10倍体积的0．2mol／L硼酸钠缓冲液（pH9．0）洗涤微珠2次，以3000g离心5min，或10 000g离心30s。
（3）用10倍体积的0．2mol／L硼酸钠（pH9．0）重悬微珠，并取出相当于10u1微珠的混悬液。加足量的DMP（固体）至终浓度为20retool／L。
如用DMP交联，应为pH 8．3以上。
（4）轻轻混匀，室温孵育30min，取出相当于10txl已偶联的微珠。
（5）用0．2mol／L乙醇胺洗涤微珠1次，以终止反应。然后用0．2mol／L悬微珠，室温孵育2h，轻轻混匀。
（6）再次洗涤后，用含0．01％硫柳汞的PBS重悬微珠。
（7）检测微珠样品与抗体结合前后的结合效率，将样品分别加入Laemmli样品缓冲液中煮沸。分别取出相当于1／Il和9btl的两种样品，在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，用考马斯亮蓝染色。结合前样品呈现重链区带（分子质量为55kDa）而结合后样品则无，表明交连成功
亲和层析柱在含硫柳汞缓冲液中置4C可保存1年以上。制备好的微珠即可用于抗原的免疫亲和纯化。
 

凝胶结合效率