植物RNA的分离

1. 总RNA的分离
总RNA分离的方法很多，常采用的是异硫氰酸胍和b-巯基乙醇这两种RNase抑制剂来抑制RNase的活性，同时，异硫氰酸胍与十二烷基肌氨酸钠（sarcosyl）共同作用可以破坏核蛋白复合体，使RNA顺利地解脱出来溶进缓冲液。由于RNA在碱性条件下不稳定，因而在整个提取过程中体系始终保持酸性至中性，而在酸性条件下DNA极少发生解离，DNA同蛋白质一起变性后被离心下来，RNA则仍溶于上清缓冲液中，zui后用异丙醇沉淀出RNA。
【试剂与仪器】
（1）异硫氰酸胍溶液：
4 mol/L异硫氰酸胍
25 mmol/LM柠檬酸钠（pH 7.0）
0.5％十二烷基肌氨酸钠
0.1 mol/L b-巯基乙醇
（2）2 mol/L NaAc（pH 4.0）：用经EDPC处理过的水配制，高压灭菌。
（3）水饱和*（pH 3.5）
【操作程序】
（1）取两只50ml离心管，各加入15ml异硫氰酸胍溶液，于冰上预冷。
（2）取5g新鲜的幼嫩植物组织放在研钵中，加入液氮，迅速研磨成均匀的粉末。
（3）将粉末全部移入冰上预冷的离心管中，振荡离心管混合均匀，将离心管置冰上。
（4）加入2mol/L NaAc 1.5ml、水饱和酚15ml和氯仿/异戊醇3ml，每加一种试剂都轻轻摇晃离心管混合均匀，zui后将离心管盖紧，倒转几次混合均匀，冰浴15分钟。
（5）4℃条件下15000g离心30分钟将上层水相移至另一干净的离心管中，向管中加入等体积的异丙醇，混匀，置－20℃冰箱冷冻1小时。
（6）4℃条件下13000g离心25分钟，小心去除上清液，沉淀溶于5ml异硫氰酸胍溶液中（体积为*次异硫氰酸胍溶液体积的1/3），再加入等体积的异丙醇，混匀后置－20℃冰箱冷冻1小时。
（7）4℃条件下13000g离心20分钟，沉淀用70％乙醇洗一遍，稍微晾干后，溶于适量体积（约500ml）EDPC处理的水中。检测后分装，于－70℃低温保存。

应注意问题及解决的方法
（1）RNA分离提取后，可以通过紫外吸收值和走电泳来策略其浓度和质量。在分光光度计上测RNA的紫外吸收值A230、A260和A280，对于纯净的RNA样品，A260/A280的比值应介于1.7至2.0之间，如果比值太小，说明可能RNA样品中污染了蛋白或是*。有好几种去除污染RNA的蛋白的方法，zui简单的就是向RNA样品中加等体积的*/氯仿（1/1）重新抽提一次，这样可以迅速地提高A260/A280的比例；当然，这样会损失大量的RNA，有时损失量达到40％。A260/A230的比值应该大于2.0，否则就可能是被异硫氰酸胍等污染了。这种情况下，必要时可以按照如下程序予以去除：①向RNA样品中加入1/10体积的2mol/L NaAc（pH4.0），然后加入等体积的异丙醇，在-20℃条件下放置30分钟。②4℃条件下10000g离心15分钟，沉淀用适当体积的1mmol/L EDTA溶解。③重复以上步骤。④用70℃乙醇洗一遍，真空抽干，沉淀溶于无RNase污染的水中。
从紫外吸收值的大小，可以比较地推算出RNA的量的多少，A260为1时相当于RNA浓度为37mg/ml。在胶上看RNA的泳动情况似乎更加直观些，植物总RNA同其他真核细胞总RNA一样总是富含两种核糖体RNA，一种是28S rRNA，另一种是18S rRNA，这两种rRNA在变性胶上的泳动位置分别大致相当于5.1kb和2.0kb的位置，它们不但可以作为分子量大小的标准，还可以作为判断RNA样品完整性的标准。一般来说，经溴化乙锭染色后，如果28S rRNA条带亮度大约为18S rRNA条带的两倍，那么说明这个RNA样品比较完整，没有发生多少降解；如果亮度的比例倒过来了，就说明28S rRNA已部分降解成一种近似于18S rRNA的分子了，这样的RNA样品完整性就不好。
（2）RNA出现降解。出现这种情况主要有几个原因，操作过程中温度太高、操作时污染了RNase以及RNase抑制剂量不足等都有可能使RNA降解，因此，首先是要做好使用器皿的RNase去除工作，其次是在整个操作过程中在低温（4℃）或是冰上进行，操作者自始至终戴手套，如果走胶检查后发现RNA仍有降解，可以按照以下程序处理：

②在抽提RNAzui后一步真空抽干以后，将沉淀溶于10ml过滤好的盐酸胍溶液，用振荡器振荡助溶。
③向其中加入1/20体积的1mol/L Hac和3/4体积的无水乙醇，置－20℃条件下至少半小时，4℃10000g离心10分钟。
④重复以上步骤两次，每次重复体积均减半。
⑤用70℃乙醇洗一次沉淀，真空干燥，溶于适量的无RNase污染的水中，电泳检测。
（3）提出的RNA应保存于－70℃，避免频繁冻融。

2 mRNA的分离
植物细胞的mRNA同其他真核细胞mRNA一样，成熟后大多在其3’端挂上一条由约20～250个腺苷酸组成的多聚腺苷尾巴Poly（A），根据这一特征，我们可以通过亲和层析的方法将mRNA同其他的RNA分开来。亲和层析柱的介质可以同Oligo（dT）纤维素或Poly（U） sepharose，它们是分别含有10～20个核苷酸（T或U）的多聚链。在高盐条件下，带有Poly（A）尾巴的mRNA就会通过Poly（A）与Oligo（dT）或Poly（U）的结合挂在柱子上，而rRNA和tRNA由于没有这种尾巴结构无法结合在柱子上，因此就被洗下去了。然后我们就可以用低盐缓冲液将挂在柱子上的mRNA洗脱出来。
【试剂与仪器】
（1）上样缓冲液（1×）：
20 mmol/L Tris·Cl（pH7.6）
0.5 mmol/L LiCl
1 mmol/L EDTA
0.1% SDS
高压灭菌，室温贮存。
（2）洗脱缓冲液：
10 mmol/L Tris·Cl（pH 7.6）
1 mmol/L EDTA
0.05% SDS
高压灭菌，室温贮存。
（3）Oligo（dT）纤维素
（4）4 mol/L NaAc（pH8.0）
（5）DEPC处理过的水。
【操作程序】
1．制备层析柱
（1）取一支硅化灭菌的巴斯德管，用洗净灭菌的玻璃棉塞上出口。
（2）取约5～15mg的Oligo（dT）纤维素悬浮于2ml上样缓冲液（1×）中，待Oligo（Dt）沉下去以后，小心移去上清液，再用上样缓冲液（1×）悬浮，重复几次至上清液*清澈，备用。
（3）吸取Oligo（dT）悬浮液装柱，注意柱中不能流干，不要有气泡。用10ml上样缓冲液（1×）洗柱。
2．层析分离mRNA
（1）取一定体积的总RNA提取液，加入等体积的上样缓冲液（2×），于65℃加热7分钟，然后冰浴5～10分钟。
（2）待洗柱的上样缓冲液都过柱后，立刻取2ml样品上柱，收集流出液，然后重新上柱，重复5～6次。
（3）用10～100ml的上样缓冲液（1×）洗柱，除去rRNA，tRNA。
（4）将洗脱缓冲液置45℃水浴预热，待第3步洗柱液流出后，加200ml洗脱缓冲液洗脱，重复5次，收集洗脱液。
（5）在分光光度计上测定各管洗脱液的RNA浓度（1.0A260=40ml/ml mRNA）。
（6）向各管洗脱液中加入4mol/L NaAc（pH6.0）至终浓度为0.2mol/L，混匀，然后加入2.5倍体积的无水乙醇，置－70℃沉淀mRNA。
（7）使用时将管取出，10000 rpm离心5分钟，真空干燥沉淀，再溶于适量的DEPC处理的水中。
 

【应注意的问题及解决的方法】
（1）在测定光吸收之前，石英比色杯要浸泡在浓盐酸中，使用时用DEPC处理的水*冲洗干净。
（2）如果洗脱液在冰上变混浊，说明样品中有SDS污染。这时可将样品在冰上放置10min 12000g离心5min，将含有RNA的上清转至干净的Eppendorf管中。
（3）如果没有洗脱出mRNA，产生的原因可能有：①RNA样品与Oligo（dT）纤维素混合不充分；②洗脱不*；③沉淀不*。