*、四环素、*多残留分析的HPLC方法

1．液相色谱法（HPLC）
（1）试剂和溶液
①*标准品
②四环素标准品
③*标准品
④乙腈（色谱纯）
⑤甲醇（色谱纯）
⑥三氯甲烷（分析纯）
⑦正己烷（分析纯）
⑧草酸（分析纯）
⑨无水*（分析纯）
⑩柠檬酸（分析纯）
⑾EDTA-Naz（分析纯）
⑿去离子水
⒀MckVaine缓冲液配制：pH 4．O
准确称取无水*28．41g（12结晶水的则称71．6gJ用水溶解并定容于1000ml容量瓶中，简称溶液A；准确称取柠檬酸2L 00g溶于水中并定容于1000ml容量瓶中，简称溶液B。取625ml溶液A和1000mi溶液B混匀，调节pH值至4．0+0．05。
⒁MCI-Vaine-Na~EDTA提取液：准确称取60、49g的EDTA—Na2，溶解于1625m1的MCI-Vaine缓冲液中，使成含O．0lmol／LEDTA-Naz的MCI-Vaine液。此溶液为提取液。
⒂0．01mol／L草酸溶液：称取草酸L 26g，用水溶解定容于1000ml容量瓶中。
⒃0．01mol几草酸甲醇溶液：称取草酸L 26g，用甲醇溶解并稀释至1000ml。
⒄标准贮备液：称取*、四环素、*标准晶各o．1080g，用甲醇溶解并定容于lOOml棕色容量瓶中。为lmg／ml贮备液，一20~C保存，3个月有效。
⒅标准中间工作液：10（~g／mI，取ling／m1贮备液2．5ml，用甲醇稀释并定容于25ml棕色容量瓶中。10t~g／m1，取10Cug／m1标准贮备液2．5ml，用甲醇稀释并定容于25ml棕色容量瓶中。
⒆标准工作液：移取适量100~g／ml或10ug／ml标准中间工作液于10ml棕色容量瓶中，加6．0ml甲醇草酸液，并用水稀释至刻度，摇匀。配制成浓度为0．05ug／m1、0．1ug／m1、0•3bg／ml、0．6ug／m1、1.2ug／ml、1．5ug／ml的系列工作液。需当日新配。
（2）测定步骤
①提取和净化 称取组织5．0g，加提取液15．0ml，三氯甲烷5ml，正己烷5nfl，匀浆邙外围冰浴，于10000r／1min下匀浆30s。用5．0ml提取液洗刀头。浆液转入50ml离心管中，振荡10min（稍微快些），于4000r／min离心10min，把提取液转入第二个50ml离心管平。原匀浆杯用l0．0ml提取液洗，再转人原50ml离心管中，洗残渣，搅匀，振荡5min，；300r／min离心5nfin，吸取提取液于第二个离心管中，合并二次提取液，于4000r／min离心mln，取上清液为样液。
取一定体积的样液过C18萃取柱0.6ml草酸甲醇，0．4ml水洗脱，进HPLC分析。
②测定
a.色谱条件
色谱柱：LUNA C18，5bm，250mmX4．6mm
保护柱：10GC4—ODS：C：s，SGE
柱温；室温
检测波长：360nm
衰减：0．00UFS
流动相：0．01mol／L草酸液+乙腈+甲醇
流速：1．0ml／min．
进样量；20uL
b．标准曲线的绘制 分别向液相色谱仪注入等体积的系列标准工作液，在上述色谱条件下检测，记录色谱峰面积。通过对药物浓度—峰面积进行回归分析，可获得标准曲线回归方程。
c样液的测定 分析样液按上述色谱条件供液相色谱仪分析。
③空白试验 除不加试样外，按上述测定步骤进行。
（3）灵敏度和回收率
本方法的检测限为50ug／kg。
回收率为70．0％-98．2％。